Ocena kliniczna diety nutraceutycznej jako czynnika wspomagającego leczenie farmakologiczne psów z suchym zapaleniem rogówki i spojówek

Zespół suchego oka

Suche zapalenie rogówki i spojówek, zwane także „zespołem suchego oka”, a u ludzi zespołem Sjögrena [1], to zaburzenie wydzielania filmu łzowego, powodujące uszkodzenie tkanek na powierzchni oka i wiążące się z dyskomfortem [2, 3] tak u ludzi, jak i u psów [ 4, 5].

Suche zapalenie rogówki i spojówek u psów

Suche zapalenie rogówki i spojówek u psów (cKCS) jest stanem zapalnym obejmującym zarówno rogówkę, jak i spojówki, związanym z niedoborem frakcji wodnej łez [6]. Częstość występowania tego schorzenia szacuje się na około 4%, biorąc pod uwagę, że wynik testu Schirmera I (STT) < 10 mm/min [7] może występować aż u 64% samców psów rasy mieszanej w wieku od 6 do 9 lat [8]. Ponadto często bywa ono niedodiagnozowane i/lub pozostaje w fazie subklinicznej [9], u niektórych ras poprzedzonej autoimmunologiczną destrukcją gruczołów łzowych [10, 11].

Mechanizmy immunologiczne, indukujące rozwój cKCS czy zespołu Sjögrena u ludzi [1], nie są dokładnie określone. Etiopatogeneza choroby jest zasadniczo wieloczynnikowa, łączy w sobie osobnicze podłoże genetyczne z wpływem czynników środowiskowych, przyczyniających się do zakłócenia procesu nabywania tolerancji immunologicznej, a w efekcie do choroby z autoimmunizacji [12, 13, 14]. W tym przypadku istotna jest rola dysregulacji fizjologicznych mechanizmów immunologicznych, skutkującej procesem autoimmunologicznym, który leży u podstaw cKCS i zespołu Sjögrena [12-15].

Warto zauważyć, że w tkankach oka wykazano nacieki z limfocytów T i B, rekrutację komórek dendrytycznych, zwiększoną ekspresję cząsteczek sprzyjających prezentacji antygenu, a także zwiększone wydzielanie cytokin prozapalnych, takich jak IFN-γ [16], co przyczynia się do zmian zapalnych w gruczole łzowym [17, 18, 19]. Proces ten zwykle prowadzi do wycieku śluzowo-ropnej wydzieliny, przekrwienia spojówek, zapalenia rogówki z neowaskularyzacją i zwiększoną pigmentacją oraz kurczu powiek, które to objawy obserwujemy w cKCS [20, 21]. Obecnie terapia tej choroby opiera się na lekach immunosupresyjnych, jak cyklosporyna A [22], glikortykosteroidy [21] i takrolimus [23], oraz na stosowaniu sztucznych łez w celu przywrócenia odpowiedniego nawilżenia oka [24]. Wśród znanych metod leczenia uzupełniającego lub alternatywnego można wymienić leki cholinergiczne (pilokarpina) [25] i zabiegi chirurgiczne (zamknięcie punktów łzowych, tarsorafia, chirurgia płata spojówki, założenie soczewek ochronnych, keratektomia powierzchowna oraz transpozycja przewodu ślinianki przyusznej) [26]. Kliniczna odpowiedź na leczenie jest zmienna, wahając się od słabej do dobrej, w zależności od stanu kliniczno-patologicznego narządu wzroku w momencie rozpoznania i od indywidualnej reakcji na leki [13].

Wśród innych niż immunologiczne przyczyn cKCS można wymienić: urazy [27], wady wrodzone [28], nosówkę [29], radioterapię [30, 31], zaburzenia neurologiczne [32], cukrzycę[33] oraz nieskorygowane wypadnięcie gruczołu trzeciej powieki [34]. Co ciekawe, większość z tych czynników może korelować z występowaniem stanu zapalnego tkanek oka i przyczyniać się zarówno do jego utrzymywania się, jak i do zaostrzeń.

Z uwagi na zmienność odpowiedzi klinicznej na klasyczne leki użyteczne może okazać się zastosowanie metod wspomagających, poprawiających skuteczność terapii farmakologicznej. Wobec tego postanowiliśmy ocenić złożony schemat leczenia, obejmujący podawanie konwencjonalnych leków i diety nutraceutycznej z zawartością składników o działaniu przeciwzapalnym / antyoksydacyjnym o potencjalnej aktywności immunomodulującej. Metodę tę zastosowano w grupie psów cierpiących na cKCS, u których samo leczenie immunosupresyjne okazało się mało skuteczne lub nieskuteczne pod względem opanowania objawów ocznych.

Dieta nutraceutyczna

Dieta nutraceutyczna stosowana w publikowanym badaniu składała się z gotowej karmy na bazie białka rybnego i węglowodanów z ryżu (zawartość 75-80%, w tym skrobi 65-70%, beta-glukanów < 0,1%), zawierającej także Cucumis melo [melon cukrowy], Ascophyllum nodosum [workoliść członowaty], astaksantynę (z alg Hematococcus pluvialis), Aloe vera [aloes zwyczajny], Carica papaya [melonowiec właściwy, czyli papaja], Punica granatum [granatowiec właściwy], Camellia sinensis [herbata chińska], Polygonum cuspidatum [rdestowiec ostrokończysty, czyli japoński], Curcuma longa [ostryż długi, czyli kurkuma], Piper nigrum [pieprz czarny], cynk i kwasy omega-3, 6 w proporcji 1 : 0,8). Wykazano już, że u psów zarażonych Leishmania infantum karma ta wywierała znaczące działanie immunomodulujące z obniżeniem odsetka limfocytów pomocniczych Th1 i zwiększeniem odsetka limfocytów Treg [35].

Melon cukrowy (Cucumis melo) wykazuje pewne działanie antyoksydacyjne i przeciwzapalne, wynikające z klirensu rodników ponadtlenkowych/nadtlenoazotynowych i modulacji wytwarzania przez makrofagi interleukiny 10 (IL-10) [36], podczas gdy aktywność immunomodulująca jest wywierana przez indukowanie polaryzacji limfocytów Th1 [37].

Aktywność alg (Ascophyllum nodosum) związana jest z obecnością askofilanu, siarczanowanego polisacharydu, zdolnego pobudzać makrofagi do wydzielania tlenku azotu, czynnika martwicy nowotworów (TNF-α) i czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów (GM-CSF) [38]. Astaksantyna, karotenoid o pomarańczowo-różowawym zabarwieniu, znana jest z wpływu na oksydację wielonienasyconych kwasów tłuszczowych [39] i modulację odpowiedzi zapalnej oraz ze sprzyjającego działania na stan zdrowia narządu wzroku u ludzi i zwierząt [40]. Indukuje blastogenezę i cytotoksyczność limfocytów u myszy [41], a także proliferację limfocytów T i B oraz cytotoksyczność limfocytów NK u ludzi [42].

Po dodaniu in vitro aloesu (Aloe vera) do hodowli komórek rogówki obserwowano spadek produkcji interleukin (IL-1, IL-6, TNF-α i IL-10 [43].

Efekt przeciwzapalny papai (Carica papaya) związany jest ze wzrostem liczby limfocytów T regulatorowych, a spadkiem limfocytów T CD4 + IFN-γ + [44]. W komórkach jednojądrzastych krwi zaobserwowano spadek stężenia IL-2 i IL-4, a wzrost IL-12, IFN-γ i TNF-α [45].

Sok i olej z nasion granatu (Punica granatum) zawierają pewne flawonoidy i antocyjanidyny (delfinidyna, cyjanidyna i pelargonidyna) o aktywności antyoksydacyjnej większej niż ekstrakt z zielonej herbaty [46, 47]. Ich działanie antyoksydacyjne związane jest z usuwaniem wolnych rodników przez antocyjanidyny [46] oraz z chelatowaniem jonów metalu [48]. Wpływ ochronny Punica granatum na układ sercowo-naczyniowy jest wiązany z hamowaniem konwertazy angiotensyny, spadkiem ciśnienia tętniczego [49] i wytwarzaniem w śródbłonku syntazy tlenku azotu [50]. Wykazano też, że hamuje on cyklooksygenazę, lipooksygenazę [51] oraz IL-1β, moduluje aktywność metaloproteinaz macierzy pozakomórkowej w chorobie zwyrodnieniowej stawów, zapobiega degradacji kolagenu [52], hamuje kinazę białkową p38 aktywowaną przez mitogen oraz aktywność jądrowego czynnika oddziałującego z sekwencją wzmacniającą lekkiego łańcucha kappa w limfocytach B (NF-kB) [53, 54] i zmniejsza stężenia dialdehydu malonowego, TNF-α, IL-1β i IL-6 [55, 56].

Antyoksydacyjne działanie zielonej herbaty (Camellia sinensis) wynika z eliminacji wolnych rodników i hamowania peroksydacji lipidów [57] przez flawonoidy (katechiny, epikatechiny, epigallokatechiny i estry kwasu galusowego) [58]. Wiadomo że 3-galusan epigallokatechiny hamuje rumień skóry, powstający pod wpływem UVB, produkcję nadtlenku wodoru, nacieki leukocytarne [59], zmniejsza ekspresję metaloproteinaz macierzy pozakomórkowej [60, 61], chemotaksję neutrofilów [62], degradację chrząstki, [63] ekspresję TNF-α [64], angiogenezę mediowaną przez neutrofile [62] oraz aktywność cyklooksygenazy-2 i obojętnej endopeptydazy [65].

Rdestowiec japoński (Cuspidatum polygonum) jest naturalnym źródłem resweratrolu, posiadającym działanie przeciwzapalne i antyoksydacyjne [66, 67]. Wykazano, że działa on bezpośrednio na kinazę TBK-1, integralny element patogenezy przewlekłych chorób zapalnych [68], i na naczynia tętnicze, aktywując ścieżkę tlenku azotu/rozpuszczalnej cyklazy guanylowej [69]. Jego działanie przeciwzapalne, jak się uważa, jest regulowane przez receptor estrogenowy α [70]. Ponadto niektóre dimery resweratrolu (partenocyzyna A, kwadrangularyna A i pallidol) tłumią działanie wolnych rodników i selektywnie usuwają pojedyncze rodniki tlenowe [71].

Kurkuma (Curcuma longa) wywiera silne działanie antyrodnikowe i przeciwzapalne [72, 73]. Kurkumina, jeden ze składników tej rośliny, zmniejsza adhezję leukocytów i wytwarzanie nadtlenków, stymuluje spontaniczną apoptozę i hamuje IL-8 [74]. Obserwowano też hamowanie odpowiedzi cytokinowej limfocytów Th1 cytokin i wytwarzania tlenku azotu w makrofagach [75]. Działanie przeciwzapalne kurkuminy polega na hamowaniu NF-kB w aktywowanych limfocytach B oraz zmniejszeniu aktywności TNF-α i IL-6, [73] oraz stymulowaniu aktywności erytroidalnego czynnika transkrypcyjnego (NFE2) [76], biorącego udział w produkcji białek zaangażowanych w mechanizmy zabezpieczające przed stresem oksydacyjnym [77].

Pieprz czarny (Piper nigrum) bywa stosowany w leczeniu grypy, przeziębienia, reumatyzmu, bólów mięśni, dreszczy, zmęczenia, gorączki, służy jako środek uspokajający, mogący również pobudzić krążenie krwi i wydzielanie śliny, łaknienie i perystaltykę jelit [78]. Wiadomo też, że zwiększa biodostępność i ułatwia przyswajanie kurkuminy [79], wpływając na dynamikę lipidów błon komórkowych w związku z niepolarnym charakterem piperyny, głównej substancji bioaktywnej z Piper nigrum. Wykazano, że piperyna sprzyja zmianom konformacji enzymów jelitowych [80] i znamiennie hamuje ekspresję głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy II, CD40 i CD86, w komórkach dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego, oraz wytwarzanie TNF-α i IL-12 w tych samych komórkach [81]. Ponadto udowodniono, że powoduje ona złagodzenie procesów zapalnych poprzez wpływ na funkcjonowanie osi przysadka – nadnercza [82], zmniejsza stres oksydacyjny wywołany dużą zawartością tłuszczu w diecie [83, 84] i pobudza pracę trzustki [85].

Niedobór cynku wpływa zarówno na odporność wrodzoną, jak i nabytą [86]. Pierwiastek ten ma zasadnicze znaczenie dla równowagi między różnymi subpopulacjami limfocytów T, a jego niedobór,jak wykazano, zmniejsza produkcję cytokin Th1 (IFN-γ, IL-2 i TNF-α), podczas gdy odpowiedź limfocytów Th2 (IL-4, IL-6 i IL-10) zostaje upośledzona w mniejszym stopniu [87]. O ile ostry niedobór cynku wydaje się korelować ze spadkiem odporności wrodzonej i nabytej, o tyle niedobór przewlekły powoduje wzrost produkcji cytokin prozapalnych (IL-1, IL-6 i TNF-α), wpływając na przebieg wielu chorób [88].

Optymalny bilans kwasów tłuszczowych omega-3 i 6 stanowi podstawowy wymóg przywrócenia homeostazy tkankowej, która ulega zaburzeniu podczas reakcji zapalnych. Wiadomo że wielonienasycone kwasy tłuszczowe (tj. eikozapentaenowy i dokozaheksaenowy), zawarte przede wszystkim w tranie, zmniejszają produkcję cytokin prozapalnych i hamują aktywność komórek NK [89]. Kwas gammalinolenowy wywiera działanie przeciwzapalne poprzez hamowanie wydzielania IL-1 p i TNF-α przez monocyty [90]. Ponadto suplementacja kwasu eikozapentaenowego może zwiększać aktywność przeciwzapalną kwasu gamma-linolenowego przez redukcję syntezy kwasu arachidonowego i prostaglandyny E2 [91].

W publikowanym badaniu oceniano zastosowanie dostępnej w handlu karmy jako adiuwantu terapeutycznego dla psów cierpiących na cKCS i niereagujących na standardowe leczenie farmakologiczne.

Materiał i metoda. Projekt doświadczenia, psy i dieta

Doświadczenie zaprojektowano jako randomizowane badanie kliniczne z placebo. Zakwalifikowano do niego 50 zwierząt należących do klientów praktyk weterynaryjnych (19 suk i 31 psów) w wieku 6,5 ± 0,7 roku [średnia ± standardowy błąd średniej (SEM)]. Rasy przedstawiały się następująco: 1 pudel, 2 jamniki długowłose, 4 jamniki gładkowłose, 4 west highland white terriery, 2 yorkshire terriery, 4 maltańczyki, 1 buldog, 2 grzywacze chińskie, 2 mopsy chińskie, 8 shih tzu, 4 owczarki niemieckie, 2 chow chow, 2 cocker spaniele, 2 setery angielskie i 10 mieszańców.

Wszystkie psy zostały wcześniej zbadane przez certyfikowanego członka Włoskiej Fundacji Zdrowia Zwierząt (dr. D. Giretto), aby potwierdzić rozpoznanie cKCS na tle immunologicznym. Kryteriami włączenia do badania były: obecność kurczu powiek, zapalenia spojówek, wysięku śluzowego, keratynizacji, neowaskularyzacji i wzmożonej pigmentacji rogówki oraz wartość STT < 10 mm/min. Kryteriami wykluczającymi były: obecność schorzeń układowych, neurologicznych, zapalenie rogówki i spojówki o etiologii neurologicznej, pourazowej lub toksycznej. Zastosowano je, by ograniczyć badaną populację do osobników z cKCS na tle immunologicznym w celu dokładniejszej oceny odpowiedzi klinicznej, a także, by lepiej interpretować ewentualne ogólne objawy nietolerancji/uczulenia na składniki badanej karmy nutraceutycznej.

Psy losowo podzielono na dwie równe grupy: 25 psów stanowiących grupę kontrolną żywiono karmą standardową (standard diet, grupa SD), a 25 jako grupa eksperymentalna otrzymywało karmę nutraceutyczną o działaniu antyoksydacyjnym/przeciwzapalnym (nutraceutical diet, grupa ND). Samce i samice były równo reprezentowane w obu grupach. Bez względu na rodzaj diety wszystkie psy były leczone w ciągu 60 dni w następujący sposób: 2x dz. krople oczne z 0,03% takrolimusu rozcieńczone roztworem chlorku benzalkonium i metylocelulozy (Lacrimart, Fedel Farma Srl, Włochy) i 5x dz. sztuczne łzy [0,2-proc. roztwór kwasu hialuronowego; Hyalistil, SIFI SpA, Włochy]. Przy badaniu uwzględniono rekomendacje ARRIVE dotyczące badań na zwierzętach [92].

W tabeli 1 podano wyjściowe dane psów z obu grup wraz z wynikami oceny klinicznej przed rozpoczęciem badania.

Obie karmy całkowicie spełniały wymogi pod względem zawartości białek, węglowodanów i tłuszczów, zaspokajając w pełni dzienne zapotrzebowanie dla psa wg wytycznych Europejskiego Zrzeszenia Producentów Karmy dla Zwierząt, dotyczących pełnej i komplementarnej żywności dla psów i kotów. Karma miała postać krokietów produkowanych przemysłowo techniką wytłaczania.

Karmy podawane w grupie ND i SD miały podobny skład pod względem głównych składników odżywczych (24% białka, 12% tłuszczów, 3,7% błonnika, 5% popiołu mineralnego, 9% wody),a także mikro- i makroelementów, w tym pierwiastków śladowych, witamin i minerałów. Różnica polegała głównie na obecności składników roślinnych w karmie ND. Karma ND składała się z: krokietów, stanowiących idealny odsetek 93-94% wagowych, oraz prasowanych na zimno drażetek stanowiących 6-7% całkowitej masy karmy (patent unijny EP 2526781 n.).

Tabletki składały się z 60-80% zhydrolizowanego białka (rybiego i roślinnego), 20-40% minerałów użytych jako substancje poślizgowe oraz dodatków terapeutycznych (Ascophyllum nodosum, Cucumis melo, Carica papaya, Aloe vera, astaksantyny z Haematococcus pluvialis, Curcuma longa, Camellia sinensis, Punica granatum, Piper nigrum, Poligonum spp., Echinacea purpurea [jeżówka purpurowa], Grifola frondosa [żagwica listkowata], Glycine max [soja warzywna], nienasycone kwasy tłuszczowe omega-3 i 6 z ryb w postaci odpowiednio 1,60% i 1,25% oleju).

Karma stosowana w grupie SD nie zawierała wymienionych substancji czynnych.

Karmy ND i SD były podawane według tabeli zaleconego zapotrzebowania dziennego (tab. 2) pod starannym nadzorem, by zapewnić wszystkim zwierzętom podobne spożycie kalorii oraz spełnienie wymagań żywieniowych dla dorosłych psów. Dla uniknięcia ewentualnych niedoborów wyliczono wartość energetyczną obu karm według formuły zawartej w wytycznych żywieniowych dla pełnych oraz uzupełniających karm dla kotów i psów oraz zapotrzebowania na składniki odżywcze psów i kotów, podanych przez Narodową Radę Badań Naukowych [% białka x 3,5 + % tłuszczu x 8,5 + % NFE (substancje bezazotowe) x 3,5]. Należna podaż karmy została wyliczona przy użyciu innej formuły: 110 kcal x kg masy ciała0,75 (źródło jw.). Stała wartość 110 określa zapotrzebowanie energetyczne psa o normalnej aktywności fizycznej.

Przy rejestracji każde zwierzę ważono i wyliczano dzienne zapotrzebowanie kaloryczne. Weterynarze udzielili właścicielom jasnych wskazówek co do prawidłowego dawkowania karmy. Średnią dzienną podaż składników roślinnych obliczono, biorąc pod uwagę ich zawartość w karmie wg deklaracji producenta oraz porcje karmy podawane poszczególnym psom. Tabela 3 ukazuje tę podaż w mg/kg stosownie do średniej wagi psów.

Badanie okulistyczne

Każdy pies był badany w dniu 0, 15, 30 i 60 przez niezależnego obserwatora (S.D., D.G., C.M.). Każdego poddano gruntownemu badaniu okulistycznemu przez trzech specjalistów okulistyki weterynaryjnej (dr M.C. Muscolo i dr S. De Stefanis posiadają certyfikaty Akademii Weterynaryjnej w Alfort, Francja, dr D. Giretto – certyfikat Akademii Weterynaryjnej w Tuluzie i jest członkiem zarządu Włoskiej Fundacji Zdrowia Zwierząt).

Badania okulistyczne obejmowało: badanie biomikroskopowe przy użyciu lampy szczelinowej (Kowa Optimed Inc SL-14, Kowa Optimed Europe Ltd, Wielka Brytania), badanie dna oka (oftalmoskop Heine Omega 180, Heine Optotechnik, Niemcy), tonometrię aplanacyjną (Tono-Pen® Vet, Reichert Technologies, USA) poprzedzoną zakropieniem do oczu 0,4% chlorowodorku oksybuprokainy (Novesina Novartis Farma SpA, Origgio (VA), Włochy) w celu minimalizacji czynników zakłócających oraz barwienie powierzchni oka fluoresceiną („minimsy” z 0,5% fluoresceiny, Laboratoires TVM, Francja) z przepłukaniem roztworem fizjologicznym 0,9-proc. NaCl (Eurospital Sp.A, Włochy).

Na każdej wizycie, odbywającej się w godzinach popołudniowych (15.00-18.00), wykonywano zdjęcie obu oczu każdego psa i rejestrowano objawy kliniczne; nasilenie pigmentacji i keratynizacji rogówki klasyfikowano wg skali zaproponowanej przez Hendrix i wsp. [93], a zapalenia spojówek i wysięku – wg propozycji przez Moore’a i wsp. [94].

– pigmentacja rogówki (0-3): 0 = brak pigmentu, 1 = tęczówka dobrze widoczna poprzez pigment, 2 = tęczówka częściowo widoczna poprzez pigment, 3 = tęczówka niewidoczna poprzez pigment;
– keratynizacja rogówki (0-2): 0 = brak, 1 = lekkie zmętnienie, 2 = umiarkowane zmętnienie; – zapalenie spojówek (0-3): 0 = normalna spojówka; 1 = lekkie przekrwienie bez obrzęku; 2 = umiarkowane przekrwienie z lekkim obrzękiem; 3 = intensywne przekrwienie z umiarkowanym/ silnym obrzękiem;
– wysięk śluzowy (0 – 3): 0 = brak widocznego śluzu lub nitki przejrzystego śluzu; 1 = rozsiane, nieprzylegające pasemka wydzieliny śluzowo-ropnej; 2 = przylegające pasma wydzieliny śluzowo-ropnej, pokrywające do 25% rogówki; oraz 3 = rozległy, przylegający wysięk śluzowo-ropny, pokrywający 25-50% rogówki.

Psy były leczone w domach pod nadzorem właścicieli, którzy podawali im leki wg opisanego schematu oraz dostarczali im obliczone porcje karmy mniej więcej co 12 godzin.

Test wydzielania łez Schirmera

Test wydzielania łez Schirmera (STT-1) jest rutynowym badaniem, polegającym na umieszczeniu standardowego paska testowego (Schirmer-Plus®, Gecis Ecoparc, Francja) w worku spojówkowym pod dolną powieką na 60 s. Dla każdego oka osobno rejestruje się wytwarzanie łez w mm/min. STT- 1 wykonano u wszystkich badanych psów.

Analiza statystyczna

Dane analizowano przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., USA). Wszystkie przedstawiono jako średnie ± standardowy błąd średniej, wyjściowo sprawdzając je pod kątem rozkładu normalnego za pomocą testu normalności D’Agostino-Pearsona. Końcowe różnice w wynikach testu Schirmera oraz w nasileniu zapalenia spojówek, keratynizacji rogówki, pigmentacji rogówki i wysięku między dwiema metodami leczenia analizowano dla każdego oka osobno za pomocą dwukierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu wielokrotnych porównań Sidaka; analizy dokonywał jeden z badaczy (A.D.C.), przed którym zaślepiono przydział do grup. Nasilenie zapalenia spojówek, keratynizacji rogówki, pigmentacji rogówki i wysięku na początku i na końcu leczenia, osobno dla każdego oka, analizowano przy użyciu testu t-Studenta. Okuliści weterynaryjni nie brali udziału w analizie statystycznej danych.

Wyniki. Kliniczna ocena okulistyczna w grupie ND i SD

W badaniu uczestniczyło 50 psów: 25 otrzymywało leczenie farmakologiczne w połączeniu z dietą standardową (grupa SD), a 25 – leczenie farmakologiczne i dietę nutraceutyczną o działaniu antyoksydacyjnym/przeciwzapalnym (grupa ND). Całkowitą liczbę (100) oczu uznano za wystarczającą, zgodnie z sugestiami w piśmiennictwie [95-97]. Wszystkie psy ukończyły 60-dniowy okres obserwacji.

Na fot. 1 ukazano ogólną poprawę stanu oka u 2 reprezentatywnych psów z grupy ND w dniu 0 (fot. 1a i c) oraz w ostatnim dniu 60-dniowego okresu obserwacji (fot. 1b i d). Należy podkreślić zwłaszcza poprawę kliniczną obserwowaną w grupie ND (fot. 1b, d) w zakresie kurczu powiek, przekrwienia spojówek, obrzęku wokół oczu i wysięku, które sugerują silny związek z podawaniem substancji nutraceutycznych, ponieważ w grupie SD nie obserwowano takiej poprawy (fot. 1f, h). W tym aspekcie, porównując stan 2 reprezentatywnych psów z grupy SD w dniu 0 (fot. 1e, g) i 60 (fot. 1f, h), nie wykazano znamiennego zmniejszenia objawów klinicznych. Kurcz powiek, przekrwienie spojówek, obrzęk wokół oczu i wysięk były nadal obecne, a jeśli się zmniejszyły, to niewystarczająco.

Wyniki te wyraźnie wskazywały na specyficzny wpływ nutraceutyków, indukujący działanie przeciwzapalne i immunomodulujące w narządzie wzroku psów zaliczonych do grupy ND. Warto zauważyć, że standardowe leczenie farmakologiczne wydaje się być zasadniczo nieskuteczne, ponieważ złagodzenia objawów nie obserwowano u psów z grupy SD. W związku z tym wpływ nutraceutyków można uważać za bardzo ważny element sprzyjający uzyskaniu poprawy klinicznej podczas leczenia farmakologicznego cKCS.

Złagodzenie objawów ocznych u psów z cKCS leczonych ND

Fot. 2 przedstawia trendy nasilenia objawów ocznych u psów z grupy SD i ND. Nasilenie zapalenia spojówek u psów w grupie ND zmniejszyło się znamiennie, z wyjściowego score 2,1 ± 0,1 do 0,6 ± 0,1, natomiast w grupie SD wartość spadku score nie była znamienna (z 2,1 ± 0,1 do 1,9 ± 0,1; fot. 2b). Również nasilenie keratynizacji rogówki zmniejszyło się znamiennie w grupie ND (z 1,5 ± 0,1 do 0,2 ± 0,1), ale nie w grupie SD (z 1,5 ± 0,1 do 1,4 ± 0,1; fot. 2c). Analogicznie, w grupie ND znamiennie obniżyły się stopień pigmentacji rogówki ( z 0,9 ± 0,1 do 0,2 ± 0,1) i nasilenie wysięku śluzowego (z 1,8 ± 0,1 do 0,3 ± 0,1), podczas gdy w grupie SD takiego efektu nie obserwowano (fot. 2d i e).

Wyniki te wyraźnie sugerują wpływ diety nutraceutycznej na zmniejszanie się score objawów ocznych u psów z cKCS, który wydaje się niezależny od leczenia farmakologicznego, jako że – jak widać w grupie SD – same leki okazały się nieskuteczne.

Jeśli chodzi o wynik STT-1, tylko u psów z grupy ND zaobserwowano znaczący wzrost wydzielania łez (z 4,7 ± 0,4 mm wyjściowo do 10,7 ± 0,6 mm po 60 dniach leczenia), natomiast nie było widać znaczącej poprawy u psów z grupy SD (wartość wyjściowa 4,3 ± 0,5 mm, końcowa 5,1 ± 0,5 mm; fot. 2a). Wyniki te świadczą o wpływie ND na wzrost wywarzania filmu łzowego u chorych psów. Można zatem przyjąć, że działanie przeciwzapalne nutraceutyków może przyczynić się do przywrócenia fizjologicznego wytwarzania łez w oczach psów dotkniętych cKCS.

Nawrót/ustąpienie objawów cKCS w zależności od stosowania ND

Po 60 dniach obserwacji u psów z grupy ND przerwano suplementację dietetyczną na 30 dni, kontynuując leczenie farmakologiczne. Warto zauważyć, że po upływie 15 dni od zaprzestania stosowania ND nastąpił szybki i intensywny nawrót objawów. U wszystkich psów wznowiono dietę ND, kontynuując farmakoterapię przez kolejne 30 dni. Co ciekawe, po powrocie do diety znów obserwowano generalną poprawę objawów (fot. 3).

Stwierdzenia te wyraźnie podkreślają specyficzne działanie nutraceutyków jako pożytecznego czynnika wspomagającego leczenie psów cierpiących na cKCS, zwłaszcza w przypadku zwierząt słabo reagujących reagujących lub niereagujących na standardowe leczenie farmakologiczne.

Dyskusja i wnioski

Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą praca ta jest pierwszą, w której proponuje się zastosowanie w cKCS określonej diety nutraceutycznej o właściwościach przeciwzapalnych/antyoksydacyjnych, tworzących optymalną kombinację składników działających synergistycznie i mogących wywierać potencjalne działanie immunomodulujące, w połączeniu ze standardowym leczeniem farmakologicznym.

Takie postępowanie wydaje się znamiennie zwiększać wytwarzanie łez i łagodzić objawy kliniczne zapalenia spojówek oraz redukować nasilenie keratynizacji i pigmentacji rogówki oraz wysięku śluzowego u psów cierpiących na przewlekłe cKCS oraz słabo lub wcale niereagujących na leki immunosupresyjne. Wyższy wynik STT w odpowiedzi na zaproponowaną dietę wykazywał zgodność z podaną wcześniej reakcją na miejscowe stosowanie cyklosporyny A i takrolimusu [23, 98, 99].

Choć nie znamy możliwych mechanizmów działania wszystkich składników w szczególności ekstraktów roślinnych, wysuwamy hipotezę, że te substancje zawarte w diecie ND mogą wywierać synergiczne działanie aktywujące limfocyty T, prawdopodobnie zapobiegając transkrypcji genów dla mediatorów zapalnych (IL-2, IL-3, IL-4, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, c-myc) [16, 100, 101]. W oparciu o możliwe mechanizmy działania wszystkich substancji czynnych w diecie ND, upodabniające efekt tej diety do efektu działania cyklosporyny, założyliśmy również, że powodują one zmniejszenie wydzielania TNF-α przez limfocyty T. Wiadomo że TNF-α zwiększa wydzielanie mucyny przez komórki nabłonka dróg oddechowych, a zatem może mieć także wpływ na wytwarzanie śluzu przez nabłonek spojówek, keratynizację rogówki i stan zapalny spojówek [102, 103]. Jednakże, jak zauważyli Hendrix i wsp., z biegiem czasu nie obserwowano całkowitej znamiennej poprawy objawów klinicznych [93].

Co ciekawe, nasze wyniki wydają się wspierać zastosowanie diety nutraceutycznej o właściwościach przeciwzapalnych/antyoksydacyjnych jako czynnika wspomagającego leczenie farmakologiczne psów z cKCS nieodpowiadającym na leki, w celu uzyskania wyników analogicznych jak u osobników reagujących na leczenie (Moore i wsp. [94], Hendrix i wsp. [93]). Dlatego nasza praca podkreśla znaczenie ewentualnego wykorzystania takiej diety u psów z cKCS jako użytecznego uzupełnienia leczenia immunosupresyjnego.

Połączenie leczenia farmakologicznego ze specyficzną dietą (Ocu-GLO Rx™) oceniali ostatnio Williams i wsp., uzyskując skuteczne opóźnienie powstawania zaćmy u psów z cukrzycą [104]. Zaproponowana przez nich karma, podawana psom z cukrzycą od chwili, gdy zaobserwowano u nich zmętnienie soczewki, zawierała inhibitor reduktazy aldozowej, kwas alfa-liponowy wspierający regenerację glutationu, ekstrakt z nasion winogron, karotenoidy, kwasy tłuszczowe omega-3 i koenzym Q10. Średni czas bez nasilenia zmętnienia soczewki wynosił 278 ± 184 dni u psów karmionych Ocu-GLO Rx™ i 77 ± 40 dni u otrzymujących placebo.

W naszym postępowaniu uwzględniliśmy połączenie kilku substancji nutraceutycznych, takich jak: hydrolizowane białko rybie, węglowodany z ryżu, Cucumis melo, Ascophyllum nodosum, astaksantynę, Aloe vera, Carica papaya, Punica granatum, Camellia sinensis, Polygonum L., Curcuma longa, Piper nigrum, cynk i wielonienasycone kwasy tłuszczowe omega-3 i 6 w proporcji 1 : 0,8, które wydaje się wywierać korzystne działanie immunomodulujące u psów z cKCS. Dane te wydają się potwierdzać wpływ diety nutraceutycznej na modulację układu odpornościowego poprzez hamowanie liczby limfocytów Th1, a pobudzanie Treg [35].

Wykazano już, że te rośliny i substancje, powszechnie stosowane w tradycyjnej medycynie, wywierają na tkanki narządu wzroku działanie antyoksydacyjne i przeciwzapalne. Warto zauważyć, że wyciąg z Camellia sinensis jest skuteczny w leczeniu zapalenia spojówek [105], a Curcuma longa w różnych chorobach oczu (przewlekłe zapalenie przedniego odcinka błony naczyniowej oka, retinopatia cukrzycowa, jaskra, związane z wiekiem zwyrodnienie plamki żółtej, zespół suchego oka) [106, 107].

Z kolei cynk, jak zaobserwowano, spowalnia progresję związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej poprzez hamowanie aktywacji dopełniacza w komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki [108], zaś kwasy tłuszczowe omega-3 i 6 wykazują wyraźną korelację z rozwojem narządu wzroku i aparatu ochronnego oka [109, 110]. Działanie antyoksydacyjne/przeciwzapalne, jakie najpewniej mają łącznie wszystkie składniki nutraceutyczne ocenianej diety, wydaje się szczególnie łagodzić immunozależne objawy oczne, zwłaszcza u tych psów z cKCS, które reagują słabo lub wcale na klasyczne leczenie immunosupresyjne.

Toteż samo leczenie farmakologiczne było w stanie zwiększyć wydzielanie łez, lecz poprawa była większa i trwalsza, gdy leki połączono z dietą ND. Podobnie redukcja objawów zapalenia spojówek była znacząco większa u psów w grupie ND (otrzymującej leki w połączeniu ze wzbogaconą karmą) niż w grupie SD (otrzymującej tylko leczenie farmakologiczne). Również pigmentacja rogówki i wysięk śluzowy zmniejszyły się tylko u psów z grupy ND. Co więcej, wystąpienie nawrotu objawów po przerwaniu diety nutraceutycznej i poprawa kliniczna po ponownym jej włączeniu wspierają hipotezę o możliwych korzyściach terapeutycznych takiej diety u zwierząt, podobnie zresztą jak w przypadku chorób oka u człowieka [111, 112].

Reasumując, nasze wyniki sugerują, że skojarzenie tradycyjnego leczenia immunosupresyjnego z dietą nutraceutyczną zawierającą składniki o działaniu antyoksydacyjnym, przeciwzapalnym, immunomodulującym powoduje znaczące zmniejszenie objawów klinicznych w KCS. Ponadto objawy te wydają się być zależne od mechanizmów immunologicznych. W tym aspekcie upośledzenie wydzielania łez może być skutkiem stanu zapalnego gruczołu łzowego i kanalików łzowych. Dlatego też uzasadnione jest wnioskowanie, że zmiany metaboliczne mogą wpływać na odpowiedź immunologiczną w modelu immunozależnych chorób narządu wzroku, w tym przypadku cKCS u psów, a patrząc z perspektywy translacyjnej również zespołu Sjögrena u ludzi.

Ograniczenia badania

Badanie to ma pewne ograniczenia. Nie oceniano na przykład stężeń cytokin prozapalnych w surowicy psów cierpiących na KCS ani odsetka limfocytów Treg we krwi. Trwające obecnie badania próbują określić uwalnianie cytokin prozapalnych oraz obecność komórek Treg we krwi obwodowej. Ich wstępne wyniki wskazują, że trudno wykryć we krwi te zmiany, które najprawdopodobniej są obecne w ściśle określonych tkankach docelowych, w tym przypadku w narządzie wzroku.

Finansowanie i konflikt interesów

Praca nie otrzymała dotacji. Żaden z autorów nie ma powiązań finansowych lub osobistych z innymi ludźmi lub organizacjami, którzy mogliby pokładać szczególne zainteresowanie w jego wynikach. Badanie zostało przeprowadzone we współpracy z niektórymi naukowcami z Działu Badawczo- Rozwojowego Sanypet SpA (co wskazano w danych autorów) zgodnie z zasadami naukowymi i etycznymi społeczności naukowej. Firma ta nie ponosiła żadnych nakładów finansowych w ramach tego projektu badawczego.

Autorzy

Simona Destefanis1, Daniela Giretto2, Maria Cristina Muscolo3, Alessandro Di Cerbo4, Gianandrea Guidetti5, Sergio Canello5, Angela Giovazzino6, Sara Centenaro5, Giuseppe Terrazzano6,7
1 Klinika Weterynaryjna Porta Venezia w Mediolanie (Włochy)
2 Klinika Weterynaryjna Cartesio w Melzo (Włochy)
3 Ambulatorium Weterynaryjne Canonica w Mediolanie (Włochy)
4 Katedra Biochemii Klinicznej, Uniwersytet im. Gabriela d’Annunzio w Chieti/Pescara (Włochy)
5 Dział Badawczo-Rozwojowy, SANYpet S.p.a. (Włochy)
6 Wydział Nauk Przyrodniczych i Technicznych, Uniwersytet Basilicata w Potenza/Matera (Włochy)
7 Katedra Medycyny Translacyjnej, Uniwersytet im. Fryderyka II w Neapolu (Włochy)

Udział autorów

S.C. i G.G. sformułowali pomysł badania. S.D., D.G., M.C.M., Sa.C., S.C., G.G., G.T. brali udział w jego projektowaniu. S.D., D.G., M.C.M. przeprowadzali badanie. S.D., D.G., M.C.M., Sa.C., A.D.C. G.T. dokonali interpretacji danych. S.D., D.G., M.G.M. Sa.C., A.D.C. i G.T. omówili wyniki i napisali
pracę. Wszyscy autorzy przeczytali i zatwierdzili wersję ostateczną.

Kwestie etyczne

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt przeprowadzono zgodnie z przepisami krajowymi i międzynarodowymi (włoskie rozporządzenie D. L. VO 116/1992 i przepis UE 86/609/WE). Wzięto również pod uwagę zalecenia CONSORT 2010 w zakresie badań z randomizacją [113]. Od właścicieli psów uzyskano pisemną zgodę (kopię złożono u redaktora naczelnego czasopisma). Ponadto, biorąc pod uwagę, że wszystkie procedury były częścią rutynowej opieki medycznej, a nie interwencji eksperymentalnej, niezależna zgoda komisji etycznej nie była konieczna.

Tłumaczenie

lek. med. Dorota Tukaj. „BMC Veterinary Research” 2016;12:214.

Fotografie, tabele i wykresy pochodzą od autorów

Piśmiennictwo :

1. Gumus K., Cavanagh D.H.: The role of inflammation and antiinflammation therapies in keratoconjunctivitis sicca. „Clin Ophthalmol.” 2009; 3:57-67.
2. Lemp M.A.: Report of the national eye institute/ industry workshop on clinical trials in dry eyes. „CLAO J.” 1995; 21(4): 221-32.
3. Lemp M.A.: Epidemiology and classification of dry eye. „Adv Exp Med Biol.” 1998; 438: 791-803.
4. Ervin A.M., Wojciechowski R., Schein O.: Punctal occlusion for dry eye syndrome. „Cochrane Database Syst Rev.” 2010;9:CD006775.
5. Barachetti L., Rampazzo A., Mortellaro C.M. etal.: Use of episcleral cyclosporine implants in dogs with keratoconjunctivitis sicca: pilot study. „Vet Ophthalmol.” 2014; 18(3): 234-41.
6. Barnett K.C., Joseph E.C.: Keratoconjunctivitis sicca in the dog following 5-aminosalicylic
acid administration. „Hum Toxicol.” 1987; 6(5): 377-83.
7. Pierce V., Williams D.: Determination of Schirmer Tear Test values in 1000 dogs. BSAVA Abstract 2006.
8. Balicki I., Radziejewski K., Silmanowicz P.: Studies on keratoconjunctivitis sicca incidence in crossbred dogs. „Pol J Vet Sci.” 2008; 11(4): 353-8.
9. Williams D.L.: Immunopathogenesis of keratoconjunctivitis sicca in the dog. „Vet Clin North Am Small Anim Pract.” 2008; 38(2): 251-68. vi.
10. Kaswan R.L., Martin C.L., Dawe D.L.: Keratoconjunctivitis sicca: immunological evaluation
of 62 canine cases. „Am J Vet Res.” 1985; 46(2): 376-83.
11. Kaswan R.L., Martin C.L., Chapman Jr W.L.: Keratoconjunctivitis sicca: histopathologic study of nictitating membrane and lacrimal glands from 28 dogs. „Am J Vet Res.” 1984; 45(1): 112-8.
12. Jonsson R., Vogelsang P., Volchenkov R. et al.: The complexity of Sjogren’s syndrome: novel aspects on pathogenesis. „Immunol Lett.” 2011; 141(1): 1-9.
13. Liu K.C., Huynh K., Grubbs Jr J., Davis R.M.: Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. „Curr Allergy Asthma Rep.” 2014; 14(1): 403.
14. Delaleu N., Jonsson M.V., Appel S., Jonsson R.: New concepts in the pathogenesis of Sjogren’s
syndrome. „Rheum Dis Clin North Am.” 2008; 34(4):833-45. vii.
15. Chauhan S.K., El Annan J., Ecoiffier T. et al.: Autoimmunity in dry eye is due to resistance
of Th17 to Treg suppression. „J Immunol.” 2009; 182(3): 1247-52.
16. Di Cerbo A., Palatucci A.T., Rubino V. et al.: Toxicological Implications and Inflammatory
Response in Human Lymphocytes Challenged with Oxytetracycline. „J Biochem Mol Toxicol.” 2016; 30(4):170-7.
17. Stern M.E., Gao J., Schwalb T.A. et al.: Conjunctival T-cell subpopulations in Sjogren’s and non-Sjogren’s patients with dry eye. „Investigative ophthalmology & visual science”2002; 43(8): 2609-14.
18. Tsubota K., Fujihara T., Takeuchi T.: Soluble interleukin-2 receptors and serum autoantibodies
in dry eye patients: correlation with lacrimal gland function. „Cornea” 1997; 16(3): 339-44.
19. Barabino S., Dana M.R.: Dry eye syndromes. „Chemical immunology and allergy” 2007; 92: 176-84.
20. Gelatt K.N.: Essentials of veterinary ophthalmology. 3rd ed. Ames: John Wiley & Sons, Inc; 1999.
21. Murphy C.J., Bentley E., Miller P.E. et al.: The pharmacologic assessment of a novel lymphocyte
function-associated antigen-1 antagonist (SAR 1118) for the treatment of keratoconjunctivitis sicca in dogs. „Invest Ophthalmol Vis Sci.” 2011; 52(6): 3174-80.
22. Kaswan R.L, Salisbury M.A., Ward D.A.: Spontaneous canine keratoconjunctivitis sicca.
A useful model for human keratoconjunctivitis sicca: treatment with cyclosporine eye drops. „Arch Ophthal.”1989; 107(8): 1210-6.
23. Berdoulay A., English R.V., Nadelstein B.: Effect of topical 0.02% tacrolimus aqueous suspension on tear production in dogs with keratoconjunctivitis sicca. „Vet Ophthalmol.”2005; 8(4): 225-32.
24. Colligris B., Alkozi H.A., Pintor J.: Recent developments on dry eye disease treatment compounds. „Saudi J Ophthalmol.” 2014; 28(1): 19-30.
25. Slatter D., Severin G.A.: Use of pilocarpine for treatment of keratoconjunctivitis sicca. „J Am Vet Med Assoc.” 1995; 206(3): 287-9.
26. Barnett K.C., Sansom J.: Diagnosis and treatment of keratoconjunctivitis sicca in the dog. „Vet Rec.” 1987; 120(14): 340-5.
27. Sansom J., Barnett K.C., Neumann W. et al.: Treatment of keratoconjunctivitis sicca in dogs with cyclosporine ophthalmic ointment: a European clinical field trial. „Vet Rec.” 1995; 137(20): 504-7.
28. Aguirre G.D., Rubin L.F., Harvey C.E.: Keratoconjunctivitis sicca in dogs. „J Am Vet Med Assoc.” 1971; 158(9): 1566-79.
29. Martin C.L., Kaswan R.: Distemper associated keratoconjunctivitis sicca. „J Am Anim Hosp Assoc.” 1985; 21: 355-9.
30. Roberts S.M., Lavach J.D., Severin G.A. et al.: Ophthalmic complications following megavoltage irradiation of the nasal and paranasal cavities in dogs. „J Am Vet Med Assoc.” 1987190(1): 43-7.
31. Jameison V.E., Davidson M.G., Nasisse M.P., English R.V.: Ocular complications following cobalt 60 radiotherapy of neoplasms in the canine head region. „J Am Anim Hosp Assoc.” 1991; 27:21-55.
32. Kern T.J., Erb H.N.: Facial neuropathy in dogs and cats: 95 cases (1975-1985). „J Am Vet Med
Assoc.” 1987; 191(12): 1604-9.
33. Cullen C.L., Ihle S.L., Webb A.A., McCarville C.: Keratoconjunctival effects of diabetes mellitus
in dogs. „Vet Ophthalmol.” 2005; 8(4): 215-24.
34. Morgan R.V., Duddy J.M., McGlurg K.: Prolapse of the gland of the third eyelid in dogs: a retrospective study of 89 cases (1980-1990).” J Am Vet Med Assoc.” 1993; 29: 56-60.
35. Cortese L., Annunziatella M., Palatucci A.T. et al.: An immune-modulating diet increases the
regulatory T cells and reduces T helper 1 inflammatory response in Leishmaniosis affected dogs treated with standard therapy. “BMC Vet Res.” 2015; 11(1):295.
36. Vouldoukis I., Lacan D., Kamate C. et al.: Antioxidant and anti-inflammatory properties of a Cucumis melo LC. extract rich in superoxide dismutase activity. „J Ethnopharmacol.” 2004; 94(1): 67-75.
37. Milind P., Kulwant S.: Musk melon is eat-must melon. „IRJP.” 2011; 2(8): 52-7.
38. 38. Jiang Z., Okimura T., Yamaguchi K., Oda T.: The potent activity of sulfated polysaccharide, ascophyllan, isolated from Ascophyllum nodosum to induce nitric oxide and cytokine production from mouse macrophage RAW264.7 cells: Comparison between ascophyllan and fucoidan. „Nitric Oxide.” 2011; 25(4): 407-15.
39. Folmer F., Jaspars M., Solano G. et al.: The inhibition of TNF-alpha-induced NF-kappaB activation by marine natural products. „Biochem Pharmacol.” 2009; 78(6): 592-606.
40. Guerin M., Huntley M.E., Olaizola M.: Haematococcus astaxanthin: applications for human health and nutrition. „Trends Biotechnol.” 2003; 21(5): 210-6.
41. Chew B.P., Wong M.W., Park J.S., Wong T.S.: Dietary beta-carotene and astaxanthin but not canthaxanthin stimulate splenocyte function in mice. „Anticancer Res.” 1999; 19(6B): 5223-7.

Streszczenie:
Suche zapalenie rogówki i spojówek u psów (canine keratoconjunctivitis sicca, cKCS) to stan zapalny narządu wzroku związany z niedoborem w frakcji wodnej łez. Etiopatogeneza choroby jest zasadniczo wieloczynnikowa, łączy w sobie osobnicze podłoże genetyczne z wpływem czynników środowiskowych, przyczyniających się do zakłócenia procesu nabywania tolerancji immunologicznej, a w efekcie do choroby z autoimmunizacji.