Badania toksykologiczne w przypadku zatrucia u zwierząt.

W praktyce klinicznej lekarze pierwszego kontaktu spotykają się z zatruciami zarówno u zwierząt domowych, jak i gospodarskich. Wynika to często z przypadkowego spożycia substancji toksycznej przez zwierzę, podania zwierzęciu leków przeznaczonych dla ludzi lub nieodpowiednich gatunkowo, a także jest wynikiem celowych działań osób trzecich. Odpowiednie rozpoznanie substancji, która wywołała zatrucie, jest kluczowe w celu podjęcia właściwego jej unieczynnienia i wyleczenia pacjenta. Badania toksykologiczne często są wykonywane także pośmiertnie jako element dochodzenia w wyniku podejrzenia o celowe otrucie zwierzęcia.

Pobieranie prób do badań

Prawidłowo pobrany materiał stanowi kluczową rolę w diagnostyce toksykologicznej. W zależności od podejrzenia, materiał powinna stanowić tkanka lub narząd, w których stężenie substancji będzie najwyższe i będzie się ona znajdować w niezmienionej formie. Materiał do badań laboratoryjnych można pobrać przyżyciowo (krew, mocz, kał, treść żołądka) lub pośmiertnie (wątroba, nerki, tłuszcz brzuszny, treść przewodu pokarmowego). Niekiedy istotne są również próbki środowiskowe (gleba, woda, pasza).

Próbki do badań należy dostarczyć do laboratorium w pojemnikach szklanych lub plastikowych, bez obecności materiałów pochłaniających jak gaza, czy ręczniki papierowe. Należy unikać pojemników metalowych. W przypadku pobrania kilku próbek z różnych narządów, każdy musi być oddzielnie zapakowany i opisany. Materiał do badań powinien być schłodzony lub zamrożony.

Do przesyłanych prób należy bezwzględnie dołączyć pismo przewodnie. Zawarte w nim informacje pomogą ukierunkować analizę, dzięki czemu skróci się czas i koszty badania.

Rodzaje badań laboratoryjnych w diagnostyce toksykologicznej:

• • Badania podstawowe, niespecyficzne (np. morfologia krwi, równowaga kwasowo-zasadowa, badania moczu, badania enzymatyczne w celu potwierdzenia/wykluczenia uszkodzenia narządów) wykonywane w celu oceny stanu zdrowia zwierzęcia

• • Badania mające na celu identyfikację substancji toksycznej w materiale biologicznym

• • Badania wykrywające skutki działania trucizny (np. MetHb, COHb, AChE)

• • Badania wykrywające substancję toksyczną w materiale podejrzanym o zatrucie (np. pasza, woda, gleba)

Aby ocenić stan pacjenta najważniejsze jest wykonanie morfologii krwi oraz podstawowych badań biochemicznych z surowicy. W przypadku podejrzenia zatrucia antykoagulantami należy wykonać badania w kierunku krzepliwości krwi. Warto oznaczyć elektrolity oraz ocenić równowagę kwasowo-zasadową. Wyniki powyższych badań wraz z oceną stanu klinicznego pacjenta i wywiadem pozwolą na postawienie wstępnej diagnozy. Zdobyte informacje pomogą ukierunkować dalsze badania toksykologiczne.

Metody badań toksykologicznych

Pierwszym etapem w diagnostyce toksykologicznej jest wstępna ocena materiału przesłanego do badań. Należy określić konsystencję próbek, zapach, zabarwienie, pH, obecność ciał obcych lub innych podejrzanych substancji. Następnie można przejść do wyodrębnienia substancji toksycznej z materiału. W tym celu wykonuje się ekstrakcję i oczyszczanie oraz mineralizację.

Chromatografia

Podstawową metodą wykorzystywaną w identyfikacji substancji toksycznych jest chromatografia. Polega ona na rozdziale składników jednorodnych mieszanin między fazę ruchomą i nieruchomą układu chromatograficznego. Wyróżnia się wiele odmian tej metody.

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) to rodzaj chromatografii cieczowej. Jest często stosowana w weterynarii ze względu na niską cenę, łatwość wykonania, identyfikację związków polarnych i niepolarnych. Niestety posiada niską swoistość w porównaniu z innymi metodami, natomiast czułość na poziomie 10^-5 – 10^-7 g. Wykorzystuje się ją do wykrywania leków, pestycydów, narkotyków, mykotoksyn.

Chromatografia gazowa (GC)

Kolejnym rodzajem badania jest chromatografia gazowa (GC). Pozwala na zidentyfikowanie i ilościowe oznaczenie nawet kilkuset komponentów mieszaniny. Umożliwia oznaczenie substancji lotnych, stabilnych termicznie i niepolarnych. Do takich substancji należą pestycydy chlorowane i fosforoorganiczne, polichlorowane bifenyle, benzyna, WWA, rozpuszczalniki, niektóre leki i alkaloidy roślinne. Zdecydowaną wadą GC jest długi czas wykonania, co wyklucza tą metodę przy diagnostyce zatruć o ostrym przebiegu, gdy substancja toksyczna musi być szybko zidentyfikowana. Jest za to przydatna w badaniach pośmiertnych.

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) to metoda, która pozwala na analizę większej ilości związków niż GC. Czas jej analizy jest jednak dłuższy. Jej czułość wynosi 10^-7 – 10^-8 g. HPLC jest wykorzystywana do wykrywania antybiotyków, fluorochinolonów, NLPZ, iwermektyny, antykoagulantów, narkotyków, mykotoksyn, pestycydów i wielu innych substancji. Stosowana jest również do monitorowania terapii.

Metody spektrofotometryczne

W analizie toksykologicznej u zwierząt zastosowanie mają również metody spektrofotometryczne, takie jak spektrofotometria UV-Vis oraz spektrofotometria IR (podczerwieni). Stosuje się je w analizie ilościowej, aby określić stężenie badanej substancji. Spektrofotometrię UV-Vis można wykorzystać do pomiaru aktywności enzymów (np. AChE) w próbkach krwi lub mózgu, stężenia substancji toksycznych (np. cyjanków) w tkankach, środków zwiotczających mięśnie. Spektrofotometria IR jest używana w analizach jakościowych oraz ilościowych.

Absorpcyjna spektrometria atomowa (AAS)

W celu oznaczenia metali ciężkich wykorzystuje się absorpcyjną spektrometrię atomową (AAS). Metoda ta pozwala na ilościowe oznaczenie pierwiastka w materiale. Jest wykorzystywana do oznaczania akumulacji metali toksycznych (np. ołów, kadm, rtęć) w tkankach i środowisku. Metodę tą charakteryzuje wysoka czułość, wykrywanie śladowych ilości, a także szybkość analizy.

Metody immunoenzymatyczne

W diagnostyce toksykologicznej używa się również metody immunoenzymatyczne, które do identyfikacji substancji toksycznych wykorzystują przeciwciała. Są to tzw. szybkie testy opierające się na chromatografii adsorpcyjnej, a odczyt polega na zmianie koloru, gdy w materiale znajduje się lub brak konkretnej substancji. Testy, mimo iż szybkie w wykonaniu i odczycie, posiadają niską specyficzność. Dodatnie wyniki powinny być dodatkowo potwierdzane przy użyciu innych metod. W weterynarii są dostępne szybkie testy do wykrywania obecności glikolu etylenowego w surowicy. Istnieją również szybkie testy do oznaczania substancji narkotycznych w moczu u ludzi. Póki co nie są one zatwierdzone do stosowania u zwierząt.

Podsumowanie

W badaniach toksykologicznych bardzo ważny element stanowi odpowiedni materiał biologiczny, przesłane pismo przewodnie oraz wstępna ocena lekarza prowadzącego. Powyższe elementy są kluczowe w celu właściwego ukierunkowania badań laboratoryjnych. Metoda badania jest dobierana na podstawie wstępnego podejrzenia substancji toksycznej oraz dostępnych próbek materiału biologicznego.

Autor:

lek. wet. Joanna Krupa

Bibliografia:

1. 1. Barski D., Diagnostyka zatruć [w:] Toksykologia weterynaryjna wybrane zagadnienia, Barski D., Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie, Olsztyn 2014
   2. Niemczycka E.A., Diagnostyka laboratoryjna w toksykologii weterynaryjnej [w:] Życie Weterynaryjne 2020, 95(12), s. 764-771
   3. Giergiel M., Współczesne wyzwania diagnostyki toksykologicznej – postępowanie w przypadkach podejrzeń o zatrucia zwierząt [w:] Życie Weterynaryjne 2017, 92(12), s. 876-880
   4. Marczuk J., Zatrucie mikotoksynami u bydła. Cz. II. Rozpoznawanie i leczenie mikotoksykoz [w:] Magazyn Weterynaryjny 2011, 12
   5. Carrozza A., Postępowanie w najczęstszych zatruciach u zwierząt towarzyszących [w:] Weterynaria po Dyplomie 2021, 02

foto: adobestock