Porównanie techniki PCR, badania mikroskopowego kału i szybkich testów diagnostycznych w wykrywaniu antygenów Giardia duodenalis u psów i kotów

Giardioza  

Giardioza jest pasożytniczą chorobą zwierząt i ludzi wywoływaną przez kosmopolityczne pierwotniaki-wiciowce z gatunku Giardia intestinalis (G. duodenalis, G. lamblia), w którym wyodrębniono 8 genotypów oznaczonych literami od A do H. Za zarażenia u psów odpowiedzialne są genotypy A, B, C i D, natomiast u kotów genotypy A, B i F (2,6)

Pasożyty te występują w dwóch formach – trofozoitów oraz cyst (forma przetrwalnikowa). Trofozoit ma wielkość 10-20 x 5-15 µm i jest kształtu gruszkowatego. W jego komórce obecne są 2 jądra, 2 aksostyle i 4 pary wici oraz krążek czepny. Rozmnażanie trofozoitów odbywa się przez podział podłużny. Cysty są owalne, wielkości 8-12 x 6-10 µm, zawierają 4 jądra i zawiązki wici (1,7)

Żywicielem Giardia spp. są: psy, koty, człowiek, gryzonie, przeżuwacze i wiele innych gatunków zwierząt.

Źródło zarażenia dla ludzi i zwierząt

Źródłem zarażenia dla ludzi i zwierząt jest woda i pokarm zanieczyszczone cystami. W środowisku zewnętrznym cysty zachowują inwazyjność przez wiele lat. Mechanicznie pierwotniaki mogą być przenoszone przez muchy, karaluchy. Okres prepatentny inwazji wynosi 4-8 dni, natomiast okres patentny kilka tygodni-miesięcy. Do zarażenia dochodzi per os. W dwunastnicy z cysty uwalniają się 2 trofozoity. Następstwem lokalizacji pasożytów w jelitach jest zniszczenie ich błony śluzowej pod wpływem mechanicznego drażnienia śluzówki oraz enzymów wydzielanych przez pierwotniaki takich jak proteinaza, peptydaza, hialuronidaza. Konsekwencją tego są zaburzenia trawienia i wchłaniania. Inwazji Giardia towarzyszy także upośledzenie wchłaniania tłuszczów, witamin A i B12, i węglowodanów. U osobników z deficytem IgA choroba ma cięższy przebieg (noworodki otrzymują IgA z mlekiem matki i wydają się mniej podatne na zarażenie). Wiciowce mogą lokalizować się także w pęcherzyku żółciowym, przewodach żółciowych i trzustkowym (6, 9).

Przebieg giardiozy u psów i kotów

Przebieg giardiozy u psów i kotów może być bezobjawowy, lub też inwazja może przyjmować formę: rzekomo-wrzodową, żołądkowo-jelitową, trzustkową, żołądkowo-wątrobową. Klinicznie choroba objawia się nudnościami, wymiotami, bólem brzucha, utratą masy ciała, wyniszczeniem oraz biegunką (kał jest półpłynny, śluzowaty, bez krwi) (14,15) .

Rozpoznawanie giardiozy

Rozpoznawanie giardiozy stawiane jest w oparciu o wyniki badania koproskopowego (mikroskopowe badanie rozmazów kały, technika flotacji), umożliwiającego wykrycie cyst w kale, badanie treści dwunastnicy (obecność trofozoitów), hodowlę pasożytów na podłożach sztucznych, wyniki PCR kału oraz wyniki szybkich testów immunologicznych wykrywających antygeny pasożytów w kale, lub koproprzeciwciała. Badania serologiczne wydają się mało przydatne w rozpoznawaniu inwazji. Przeciwciała IgG w surowicy zwierząt utrzymują się długo, natomiast IgM krótko, a spadek ich mian ma miejsce po 2-3 tygodniach (6,14)

Zwalczanie inwazji Giardia

Skuteczność w zwalczaniu inwazji Giardia u psów i kotów wykazują: metronidazol 12,5-25 mg/kg p.o 2 x dz. przez 5 dni, tinidazol 44 mg/kg 2 x dz. przez 4-5 dni, albendazol 25 mg/kg 2x dz. przez 2-4 dni, fenbendazol 50 mg/kg przez 3-5 dni (6,14,16)

Istotne w zapobieganiu chorobie jest dbanie o higienę i czystość w otoczeniu zwierząt (na wybiegach, w klatkach, kuwetach itp.). Cysty Giardia są wrażliwe na wysychanie i wysoką temp (60C). Najskuteczniejszą metodą ich inaktywacji jest stosownie gorącej pary. W Stanach Zjednoczonych dostępne są szczepionki chroniące przeciwko inwazjom pierwotniaków dla psów (Giardia Vax-FDAH) oraz kotów (Fel-O-Vax Giardia).

Giardioza u psów i kotów w Polsce i Europie

Obserwacje poczynione w ostatnich latach w Polsce i Europie wskazują, że problem giardiozy u psów i kotów ulega nasileniu (4,8,10,12,13). Jest to o tyle istotne, że giardioza jest zoonozą, a zwierzęta towarzyszące mogą stanowić rezerwuar zarazka dla ludzi (6,14,15). Szybkie rozpoznanie zarażenia i wdrożenie odpowiedniego leczenia psów i kotów stanowi więc istotny element ochrony zdrowia publicznego. Ponieważ w wielu przypadkach przebieg giardiozy jest ostry, a jak wiadomo, żeby uzyskać wyniki badań serologicznych i molekularnych potrzeba czasu, coraz częściej i chętniej lekarze weterynarii w rozpoznawaniu tej jednostki chorobowej wykorzystują szybkie testy płytkowe.

Celem pracy było porównanie klasycznej techniki PCR z mikroskopową analizą rozmazów kału, szybkimi testami Vet Expert Giardia Ag oraz szybkimi testami Snap Giardia IDEXX do wykrywania antygenów Giardia spp. w kale psów i kotów.

Badania własne

Materiał do badań stanowiły próbki kału pobrane od 19 psów, z objawami biegunek, w których badaniem PCR wykazano obecność DNA Giardia, oraz próbki kału pobrane od 21 kotów, z objawami biegunek, w których badaniem PCR potwierdzono obecność DNA Giardia. Grupę kontrolną stanowiły próbki kału pobrane od 7 zdrowych psów i 7 zdrowych kotów, nie zdradzających objawów klinicznych choroby, w których badaniem PCR nie stwierdzono obecności materiału genetycznego Giardia.

Całkowite DNA z kału izolowano za pomocą zestawu Clean Stool DNA Kit (DNA Gdańsk). Detekcję materiału genetycznego Giardia (gen 16S RNA) w klasycznym PCR dokonano w oparciu o metodykę podaną przez Hopkinsa i wsp. (5).

Dodatkowo kał pobrany od zwierząt poddawano badaniu mikroskopowemu, a następnie wykonywano szybkie testy immunologiczne. Badanie kału za pomocą testów Vet Expert Giardia Ag oraz Snap Giardia IDEXX wykonano zgodnie z instrukcją podaną przez producenta tych zestawów.

Spośród przebadanych próbek kału obecność materiału genetycznego Giardia (gen 16SRNA, wielkość produktu ok. 292 pz.) stwierdzono w 19 próbkach kału pobranego od psów grupy badanej oraz 21 próbkach kału pobranego od kotów grupy badanej. W żadnej próbce kału pobranej od zwierząt z grupy kontrolnej (7 psów i 7 kotów) badaniem molekularnym nie stwierdzono obecności DNA Giardia.

Mikroskopowym badaniem rozmazów kału próbek dodatnich w PCR, obecność cyst stwierdzono w kale 16 psów oraz 18 kotów (Ryc.2). W kale trzech psów i trzech kotów, pomimo dodatnich wyników badania PCR w kierunku Giardia, wyniki analizy mikroskopowej były ujemne. Zgodność dodatnich wyników badania PCR oraz mikroskopowego rozmazów kału wynosiła 85%.

W żadnej próbce kału z grupy kontrolnej, badaniem mikroskopowym rozmazów nie stwierdzono obecności cyst, jak i postaci dorosłych Giardia. Zgodność ujemnych wyników badania PCR oraz badania mikroskopowego rozmazów kału wynosiła 100%.

Wyniki badania próbek kału testem Vet Expert Giardia Ag

Spośród czterdziestu próbek kału psów i kotów, w których badaniem PCR wykazano obecność materiału genetycznego Giardia wyraźnie dodatnie wyniki testu Vet Expert Giardia Ag (++) uzyskano dla 38 próbek. W przypadku jednej próbki (kał kota) dodatniej w PCR, natomiast ujemnej w badaniu mikroskopowym wynik testu był słabo dodatni (+). W kolejnej próbce kału (kał kota) dodatniej w PCR oraz w badaniu mikroskopowym testem Vet Expert Giardia Ag nie stwierdzono obecności antygenów pierwotniaków. Zgodność wyników dodatnich testu Vet Expert Giardia Ag z wynikami dodatnimi PCR wynosiła więc 97,5%.

Wszystkie próbki kału ujemne w badaniu mikroskopowym, a dodatnie w teście PCR, w teście Vet Expert Giardia Ag reagowały również dodatnio.

Dla wszystkich 14 kontrolnych próbek kału, ujemnych w badaniu PCR oraz w badaniu mikroskopowym, w teście Vet Expert Giardia Ag uzyskano również wynik ujemny. Zgodność wyników ujemnych wynosiła więc 100%.

Wyniki badania próbek kału testem Snap Giardia IDEXX

Spośród czterdziestu próbek kału psów i kotów, w których badaniem PCR wykazano obecność materiału genetycznego Giardia, dodatnie wyniki testu uzyskano dla 34 próbek. W przypadku 4 próbek kału pobranych od jednego psa i trzech kotów dodatnich w PCR natomiast ujemnych w badaniu mikroskopowym wynik testu był ujemny (+). Wynik testu Snap Giardia IDEXX dla kolejnych dwóch próbek kału pobranego od kotów był również ujemny, podczas gdy próbki te zarówno w badaniu PCR, jak i badaniu mikroskopowym były dodatnie. Zgodność dodatnich wyników testu Snap Giardia IDEXX z wynikami dodatnimi PCR wynosiła 85%.

Dla wszystkich 14 kontrolnych próbek kału, ujemnych w badaniu PCR oraz w badaniu mikroskopowym, w teście Snap Giardia IDEXX uzyskano również wynik ujemny. Zgodność wyników ujemnych wynosiła więc 100%.

Omówienie

Szacuje się, że w Polsce około 5-54% psów i 5% kotów jest zarażonych Giardia (6). W ostatnim czasie na rynku produktów weterynaryjnych pojawia się coraz więcej szybkich zestawów diagnostycznych dla psów i kotów pozwalających na wykazanie w organizmie podejrzanego zwierzęcia antygenów Giardia spp (3,4,11). Jak podają producenci czułość, jak i swoistość tych testów jest wysoka, co potwierdzają wyniki badań własnych którymi objęto najpopularniejsze testy wykorzystywane przez lekarzy weterynarii w Polsce.

W badaniach własnych przyjęto, że metodą diagnostyczną, do wyników której odnoszone będą wyniki szybkich testów będzie PCR. Techniką PCR obecność materiału genetycznego potwierdzono w 40 próbkach kału psów i kotów, które to próbki następnie analizowano przy wykorzystaniu szybkich testów oraz badając mikroskopowo rozmazy kału.

Wykazano, że w odniesieniu do wyników dodatnich PCR, najwyższą zgodność wykazały testy Vet Expert Giardia Ag 97,5%, następnie Snap Giardia IDEXX 85% i badanie mikroskopowe 85%.

Badając próbki kontrolne kału pochodzące od zwierząt zdrowych, żadną z technik nie stwierdzono w nich obecności pasożytów Giardia. Zgodność wyników wynosiła 100%.

Szybkie testy wykrywające antygeny Giardia w kale stanowią skuteczne narzędzie diagnostyczne w wykrywaniu inwazji pierwotniaków u psów i kotów porównywalne z PCR. Nie stwierdzono, by w testach tych uzyskiwano wyniki fałszywie pozytywne.

Obserwacje własne wskazują, na wysoką czułość badanych testów, które mogą być z powodzeniem wykorzystywane w badaniach klinicznych i epidemiologicznych prowadzonych nad giardiozą psów i kotów w Polsce. Podkreślić jednak należy, iż wyniki omawianych testów należy odpowiednio interpretować, odnosząc uzyskane rezultaty do objawów klinicznych obserwowanych u pacjentów.

Autorzy:

Prof. dr hab. Łukasz Adaszek¹, dr Klaudiusz Szczepaniak², dr Marcin Garbal³, lek. wet. Natalia Jackowska-Pejko⁴, lek. wet. Małgorzata Rutkowska-Szulczyk⁴

¹Katedra Epizootiologii i Klinika Chorób Zakaźnych, Wydział Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytet Przyrodniczy Lublin.

² Katedra Parazytologii i Chorób Ryb, Wydział Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytet Przyrodniczy Lublin.

³ Vethouse

⁴Vet Planet Sp. z o.o. ul. Brukowa 36 lok. 2, 05-092 Łomianki