Konserwacja nasienia

Rozwój hodowli zwierząt towarzyszących oraz zwiększenie ilości gatunków zwierząt zagrożonych wyginięciem niesie za sobą konieczność doskonalenia metod konserwacji gamet i przechowywania materiału genetycznego. Odpowiedzią na rosnące zapotrzebowanie jest coraz większa dostępność placówek oferujących możliwość konserwacji nasienia w niskich temperaturach.

Konserwacja w niskich temperaturach

Metodami konserwacji nasienia w niskich temperaturach są chłodzenie nasienia oraz mrożenie w ciekłym azocie czyli kriokonserwacja. W obu metodach niezwykle istotnym jest używanie fakcji nasiennej, co jest możliwe poprzez zebranie do probówki jedynie drugiej frakcji podczas pobierania nasienia lub oddzielenie plemników zawieszonych w plazmie nasienia poprzez wirowanie (300-500x g, 5 min).

Przed rozpoczęciem procedur należy pamiętać o identyfikacji zwierzęcia, czyli sprawdzeniu numeru czip bądź tatuażu. Niezbędnym jest również wykonanie badań w kierunku Brucella canis, gdyż zapobieganie rozprzestrzenianiu chorób przenoszonych drogą płciową (a zwłaszcza zoonoz) powinno być traktowane priorytetowo.

Chłodzenie nasienia

Procedura przygotowywania chłodzonego nasienia jest znacznie mniej skomplikowana i czasochłonna niż mrożenie. Należy jednak mieć na uwadze, że trwałość nasienia chłodzonego wynosi kilka dni i żywotność oraz ruchliwość plemników ulegają pogorszeniu wraz z upływającym czasem. Na rynku dostępne są komercyjne preparaty służące do rozrzedzenia chłodzonego nasienia, ale wiele placówek wciąż korzysta z samodzielnie robionych rozrzedzalników. Najczęściej zawierają one żółtko jaja kurzego, które zapobiega szokowi termicznemu plemników. Rozrzedzalnik dodaje się do frakcji nasiennej ejakulatu w stosunku 1:2 lub 1:3, w zależności od koncentracji plemników. Następnie należy stopniowo schładzać próbkę aż do osiągnięcia temperatury 4^OC.

Kriokonserwacja

Mrożenie nasienia w ciekłym azocie jest zdecydowanie bardziej pracochłonną metodą, ale jej niewątpliwym plusem jest możliwość przechowywania zamrożonego materiału praktycznie w nieskończoność. Obecnie w wielu bankach nasienia znajdują się próbki pobrane wiele lat temu od psów, które obecnie już nie żyją. Dzięki takiemu długoterminowemu przechowywaniu, możliwe jest zwiększanie puli genetycznych, tworzenie ciekawych skojarzeń między osobnikami oraz przewożenie/ wysyłka nasienia na dalekie odległości.

Sama procedura składa się z kilku etapów, tj. rozrzedzenie, schładzanie do temp. 4 ^OC, ekwilibracja w parach ciekłego azotu oraz mrożenie w -196 ^OC. Do frakcji nasiennej, podobnie jak opisywano w akapicie dot. Nasienia chłodzonego, dodawane są specjalistyczne rozrzedzalniki zawierające krioprotektanty.

Na rynku dostępne są komercyjne preparaty, ale takie rozrzedzalniki można przygotować samemu w warunkach laboratoryjnych. Podstawą są substancje buforujące (np. Tris z dodatkiem kwasu cytrynowego). Niezwykle istotnym elementem każdego rozrzedzalnika do mrożenia nasienia jest glicerol. Jego działanie polega na wiązaniu cząsteczek zewnątrz- i wewnątrzkomórkowej wody i tym samym zapobieganiu uszkodzeniom plemników podczas zamarzania. Kolejnym istotnym elementem jest żółtko jaja kurzego, które jest również składową rozrzedzalników do chłodzenia nasienia.

Dawniej nasienie mrożono i przechowywano w postaci tzw. Kulek, które umieszczano w specjalnych krioprobówkach. Obecnie metoda ta jest rzadziej używana, ze względu na rozmiar przechowywanej próbki. Najpopularniejszą metodą jest korzystanie z jednorazowych słomek o pojemności 0,5 ml (ryc. 1) lub 0,25 ml. Słomki uzyskane od jednego psa, przechowuje się w tzw. gobletach pomagających uporządkowywać i identyfikować próbki w kontenerach z ciekłym azotem.

Każdorazowo przed inseminacją (zarówno chłodzonym jak i mrożonym) należy sprawdzić jego jakość po ogrzaniu tj. ocenić podstawowe parametry takie jak ruchliwość oraz ruch postępowy plemników. Tylko nasienie o zadowalającym odsetku plemników poruszających się prawidłowo, może zostać użyte.

Liofilizacja

Przechowywanie komórek (min. plemników) w stanie wysuszonym wydaje się być dość ciekawą metodą opracowaną przez biotechnologów. Pierwszym tego typu ośrodkiem jest placówka znajdująca się w Izraelu, potocznie zwana przez pracowników Arką Noego. Opracowano tam technologię pozwalającą na „wysuszenie” ejakulatu i przechowywanie go w temperaturze pokojowej. Co istotne, po ponownym upłynnieniu plemniki zachowują żywotność oraz zdolności zapłodnieniowe. Obecnie brak jest ośrodków komercyjnie wykonujących taką usługę, aczkolwiek przechowywanie materiału w temperaturze pokojowej, w małych fiolkach wydaje się być obiecującą alternatywą. Zaprzestanie użycia dużych kontenerów z azotem umożliwi przechowywanie większej ilości próbek na mniejszej powierzchni oraz zredukuje ryzyko wynikające z pracy z ciekłym azotem.

Autor:

lek. wet. Kinga Domrazek

Pracownia Rozrodu Małych Zwierząt, Katedra Chorób Małych Zwierząt i Klinika, Instytut Medycyny Weterynaryjnej, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego

Bibliografia

1. 1. Arav A. From cryo-preservation to dry-preservation of reproductive cells. Theriogenology. 2020 Jul 1;150:263-267. doi: 10.1016/j.theriogenology.2020.01.060. Epub 2020 Feb 19.
   2. Domrazek K. https://weterynarianews.pl/techniki-oceny-jakosci-nasienia-u-psow/
   3. Dubiel A. Rozród psów. Rozdz. 5 Wydawnictwo Akademii Rolniczej we Wrocławiu,2004
   4. Johnston S. D, Root Kustritz M. V., Olson P.N.S, Canine and Feline Theriogenology, wyd. SAUNDERS, 2001, rozdz. 13