Metody badań hematologicznych w weterynarii

Badanie krwi jest podstawowym badaniem laboratoryjnym wykorzystywanym w diagnostyce weterynaryjnej. Krew jako materiał biologiczny, dostarcza wielu informacji na temat stanu zdrowia zwierzęcia, rozwoju procesu chorobowego, a także postępów we wdrożonej farmakoterapii. W weterynarii wyróżnić można kilka metod badania hematologicznego.

Właściwe pobranie próbki krwi jest kluczowe dla uzyskania miarodajnego wyniku badania. Krew do badań morfologicznych pobieramy na probówkę z antykoagulantem, u psów i kotów najczęściej na EDTA (nie wpływa on na morfologię komórek). U niektórych ptaków, gadów i ryb jako antykoagulant ma zastosowanie heparyna. Konieczne jest kilkukrotne wymieszanie krwi w probówce w celu uniknięcia powstania skrzepów, które mogą zafałszować wynik badania.

Ocena makroskopowa

Już na etapie pobrania można wstępnie ocenić próbkę poprzez ocenę makroskopową. Prawidłowo pobrana krew żylna jest ciemnoczerwona, nie zawiera zaglutynowanych erytrocytów. Zmiana zabarwienia na brunatne może świadczyć o methemoglobinemii. Występowanie czerwonych grudek wskazuje na aglutynację krwinek czerwonych.

Kapilary mikrohematokrytowe

Kapilarę wypełnia się dobrze zmieszaną krwią, zamyka na jednym końcu, po czym umieszcza w wirówce na kilka minut. Próbka krwi rozdziela się na trzy warstwy pod wpływem różnicy gęstości poszczególnych frakcji komórek. Na dnie znajdują się erytrocyty, nad nimi kożuszek leukocytarno-płytkowy, na samej górze osocze niezawierające komórek. To badanie umożliwia pomiar hematokrytu, poprzez ocenę warstwy erytrocytów w stosunku do pozostałych warstw próbki, stosunkową liczbę leukocytów i trombocytów (wykrycie leukocytozy lub leukopenii), ocenę zabarwienia osocza. Prawidłowo osocze powinno być przejrzyste, bezbarwne. Zmiana jego zabawienia na żółte sugeruje występowanie hiperbilirubinemii. Jeśli żółtemu zabarwieniu osocza towarzyszy znaczny spadek hematokrytu, można podejrzewać hiperbilirubinemię spowodowaną zwiększonym rozpadem erytrocytów. Białe zabarwienie osocza wskazuje na występowanie lipemii. Może być ona spowodowana niedawnym posiłkiem lub występowaniem chorób takich jak np. cukrzyca, zapalenie trzustki, niedoczynność tarczycy. Osocze w kolorze czerwonym wskazuje na obecność hemoglobiny. Kroplę osocza z kapilary można umieścić na refraktometrze w celu oceny stężenia białka całkowitego. W kapilarze mikrohematokrytowej możliwy jest również pomiar stężenia fibrynogenu, poprzez ogrzanie próbki do temperatury 56-58°C przez kilka minut. W tej temperaturze fibrynogen wytrąca się z osocza. Różnica między stężeniem białka całkowitego osocza przed i po podgrzaniu określa zawartość fibrynogenu.

Analizatory hematologiczne

Aby określić liczbę poszczególnych komórek krwi najczęściej stosuje się analizatory hematologiczne. W zależności od rodzaju działają one na zasadzie oceny kożuszka leukocytarno-płytkowego, metody impedancji (3-Diff), laserowej cytometrii przepływowej (5-Diff) lub metody cytochemicznej.

Najpowszechniej używane analizatory działają na zasadzie impedancji – krew rozcieńczona elektrolitem przepływa między dwiema elektrodami przez otwór. Komórki krwi zwiększają opór, dzięki czemu powstają impulsy elektryczne. Im wyższe impulsy tym większa objętość komórek, natomiast liczba impulsów jest proporcjonalna do liczby komórek zawartych we krwi. Na podstawie objętości komórki krwi są przypisywane do poszczególnych populacji. Leukocyty są najczęściej różnicowane na trzy lub cztery populacje. Analizatory impedancyjne mogą być z powodzeniem stosowane w przypadku zwierząt zdrowych lub zwierząt o znanej chorobie układu czerwonokrwinkowego, jednak nie są wystarczające do dokładnej oceny leukocytów i trombocytów, ani w przypadku występowania dużych nieprawidłowości w obrazie krwi.

Rozmazy krwi

Rozmaz należy wykonać jak najszybciej po pobraniu próbki krwi. Zaleca się wykonanie kilku rozmazów z jednej próbki, aby w razie wątpliwości przesłać preparaty do dalszej analizy. Rozmazy można wykonać różnymi metodami: na szkiełku podstawowym, na szkiełku nakrywkowym lub metodą automatyczną (preparat cytospinowy). Istotne jest, aby na szkiełku znalazła się jedna warstwa nieuszkodzonych komórek.

Kroplę krwi należy umieścić na jednym końcu odtłuszczonego szkiełka podstawowego. Drugie szkiełko umieszczamy pod kątem 30-45° względem leżącego szkiełka, przesuwamy od drugiego końca w stronę kropli, tak, aby po zetknięciu z krwią jej kropla rozpłynęła się wzdłuż brzegu rozmazującego szkiełka. Następnie jednostajnym ruchem przesuwamy szkiełko rozmazujące w kierunku przeciwnym do kropli. Tak uzyskany rozmaz powinien być grubszy z jednej strony, natomiast z drugiej cieńszy, tworzyć kształt pióra. Przy wykonywaniu rozmazu istotna jest wielkość kropli krwi, kąt nachylenia szkiełka, nacisk, szybkość rozprowadzania kropli. Przed barwieniem rozmaz powinien być wysuszony w temperaturze pokojowej, na powietrzu. Nie zaleca się używania suszarki, aby przyspieszyć ten proces, gdyż jej powietrze może powodować uszkodzenie komórek krwi.

Odpowiednio wyschnięty rozmaz należy zabarwić metodą Romanowskiego lub jego pochodnymi (barwienie Wright, Wright-Giemsa, May-Grunwald-Giemsa). Przy rutynowej ocenie preparatów w gabinecie sprawdzą się zestawy do szybkiego barwienia (tzw. Diff-Quick).

Zabarwiony rozmaz ocenia się początkowo pod powiększeniem x100. Pod tym powiększeniem można ocenić, czy leukocyty są rozmieszczone równomiernie w preparacie, czy nie występują zlepy komórek. Należy zwrócić uwagę na występowanie atypowych komórek, zlepów trombocytów, aglutynację erytrocytów. W następnej kolejności należy przejść do powiększenia x200. Na tym powiększeniu można dokonać pomiaru szacunkowej liczby leukocytów. Na powiększeniu imersyjnym x1000 można ocenić erytrocyty, płytki krwi.

Rozmazy krwi są pomocne przy ocenie próbki krwi w przypadku występowania zlepów trombocytów, które mogą być pominięte przez analizatory hematologiczne lub wliczone do puli leukocytów. W przypadku występowania płytek olbrzymich, które wskazują na aktywną trombopoezę, analizatory wliczają je do puli erytrocytów, zawyżając ich liczbę. Sytuacja ta ma miejsce szczególnie u kotów.

Ocena rozmazu jest przydatna w sytuacji występowania nietypowych zmian w morfologii leukocytów. Możliwe jest różnicowanie przesunięcia w lewo obrazu białokrwinkowego, które występuje w przypadku toczącego się ostrego procesu zapalnego. Możliwe jest wykrycie hipersegmentacji jąder neutrofilii, zmian toksycznych w komórkach, występowanie limfocytów atypowych oraz komórek nowotworowych.

W przypadku erytrocytów, rozmaz nie jest wiarygodną metodą w celu ustalenia ich liczby. Jednak na podstawie rozmazu możliwe jest wykrycie aglutynacji czerwonych krwinek, polichromazji, erystroblastozy, można ocenić stopień anizocytozy (różna wielkość krwinek), a także oznaczyć erytrocyty o nietypowych kształtach (poikilocytoza). Rozmaz krwi umożliwia również wykrycie ciałek wtrętowych oraz pasożytów krwi.

Podsumowanie

Na badanie hematologiczne powinno składać się kilka metod, które wzajemnie się uzupełniają. W przypadku badań rutynowych analiza próbki krwi na analizatorze hematologicznym może być wystarczająca, jednak w przypadku podejrzenia choroby dotyczącej układu krwiotwórczego niezbędne jest wykonanie rozmazu i jego prawidłowa interpretacja.

Autor:

lek. wet. Joanna Krupa

Bibliografia:

1. 1. Meyer J. D., Harvey J. W., Metody badań hematologicznych [w:] Diagnostyka laboratoryjna w weterynarii, Elsevier Urban & Partner, Wrocław 2013
   2. Harvey J.W., Procedury hematologiczne [w:] Hematologia Weterynaryjna, Przewodnik diagnostyczny z kolorowym atlasem, Elsevier Urban & Partner, Wrocław 2014
   3. Cymerman M., Skrzeczyńska M., Analiza morfologiczna krwi – czy wydruk z aparatu wystarczy? [w:] Magazyn Weterynaryjny 2015, nr 12
   4. Kumiega E., Badanie morfologii krwi obwodowej – czy rodzaj analizatora hematologicznego i metoda jego działania mają znaczenie? [w:] Weterynaria w praktyce 2018, nr 5, s. 92-97

foto: adobestock