Mikrobiologia to dziedzina nauk biologicznych, która nieustannie towarzyszy lekarzom weterynarii w codziennej praktyce. Zarówno infekcje bakteryjne, jak i grzybicze, są częstym powodem wizyt w gabinetach weterynaryjnych. Badania mikrobiologiczne wykorzystywane są również przy sprawdzaniu jakości żywności pochodzenia zwierzęcego. W niniejszym artykule zostaną opisane techniki diagnostyczne, które są najczęściej wykorzystywane w celu wykrycia i identyfikacji patogenów.

1. 1. Metoda hodowlana

Hodowla drobnoustrojów, inaczej posiew mikrobiologiczny, to najstarsza metoda diagnostyki chorobotwórczych bakterii oraz grzybów. Mimo to wciąż jest jedną z najczęściej wykorzystywanych technik. Jest to tzw. “złoty standard” w diagnostyce bakteriologicznej. Zasada hodowli polega na wyizolowaniu patogenu z materiału biologicznego, wykorzystując jego wymagania odżywcze oraz optymalizując warunki atmosferyczne niezbędne do jego wzrostu i namnożenia.

Metodę hodowlaną można podzielić na kilka etapów:

• • wstępne przed namnażanie

• • namnażanie na podłożu selektywnym

• • posiew na podłoże różnicujące

• • badania biochemiczne wyizolowanych kolonii

Ze względu na konsystencję wyróżniamy podłoża:

• • płynne – służą przede wszystkim do namnażania drobnoustrojów

• • półpłynne – wykorzystywane do badania zdolności ruchu bakterii

• • stałe – umożliwiają izolację pojedynczych kolonii

Pod względem zawartości substancji odżywczych znajdziemy podłoża:

• • podstawowe – zawierają składniki podtrzymujące żywotność patogenów

• • odżywcze – pozwalają na wzrost bakterii

• • wzbogacone – mają w składzie dodatkowe substancje wzrostowe, np. krew, dzięki czemu umożliwiają wzrost bardziej wymagających drobnoustrojów

Biorąc pod uwagę zastosowanie uwzględniamy podłoża:

• • transportowe – minimalne utrzymanie żywotności

• • namnażające – optymalny wzrost bakterii

• • selektywne (wybiórczo-namnażające) – umożliwiony wzrost niektórych bakterii, hamowanie pozostałych

• • różnicujące – rozróżnienie określonych grup bakterii

• • wybiórczo-różnicujące – właściwości podłoży selektywnych i różnicujących

• • podłoża do badania lekowrażliwości

W celu uzyskania pojedynczych, odizolowanych kolonii nadających się do dalszej identyfikacji, wyróżniamy dwa rodzaje posiewów. Posiew powierzchniowy na podłoże stałe, wykonywany za pomocą ezy (posiew redukcyjny) lub pipety i głaszczki. Drugim rodzajem jest posiew wgłębny, w którym zawiesinę wyjściową nakrapiamy na pustą płytkę Petriego, następnie zalewamy upłynnionym i schłodzonym do odpowiedniej temperatury podłożem.

Sterując temperaturą, potencjałem oksydoredukcyjnym lub pH podłoża, a także stężeniem CO2 w środowisku hodowli, uzyskujemy wzrost wybranych drobnoustrojów, jednocześnie hamując florę towarzyszącą.

Hodowla umożliwia wstępną identyfikację bakterii na podstawie ich właściwości biochemicznych. Dzięki niej można również oznaczyć antybiotykowrażliwość bakterii. Pozwala na uzyskanie materiału niezbędnego do dalszych badań (serologicznych, molekularnych).

2. 2. Metoda mikroskopowa

Preparaty mikroskopowe pozwalają wstępnie przydzielić drobnoustroje do grupy ze względu na ich wielkość (np. ziarniaki, pałeczki, laseczki), kształt konglomeratów bakteryjnych (np. gronkowce, paciorkowce) oraz budowę ściany komórkowej (bakterie Gram+ i Gram -). W przypadku niektórych bakterii w badaniu mikroskopowym możemy zaobserwować ich ruch, np. Campylobacter spp. zawieszone w podłożu płynnym, które wykazują charakterystyczny, korkociągowy ruch.

Preparat do badania mikroskopowego może pochodzić bezpośrednio z materiału biologicznego, np. badanie osadu moczu, preparat odciskowy zmienionej chorobowo powierzchni. Metodę mikroskopową wykorzystuje się także do identyfikacji lub potwierdzenia patogenów uzyskanych w metodzie hodowlanej.

3. 3. Badania serologiczne

Serotypowanie bakterii to badanie szczególnie przydatne przy drobnoustrojach, które prezentują różne odmiany (szczepy). Dzięki temu badaniu możliwe jest określenie ich struktury antygenowej. Metoda polega na zawieszeniu czystej kolonii bakteryjnej w kropli surowicy zawierającej przeciwciała skierowane przeciwko konkretnym antygenom somatycznym (O) lub rzęskowym (H). Reakcja dodatnia uwidacznia się w postaci wytrąconych kłaczków. Metoda ta jest z powodzeniem stosowana przy określaniu serotypów bakterii Salmonella spp.

4. 4. Badania biologii molekularnej

Badania molekularne, na czele z badaniem metodą PCR (polymerase chain reaction) są coraz częściej wykorzystywane w weterynaryjnej diagnostyce bakteriologicznej. Metoda PCR polega na powielaniu (amplifikacji) fragmentu DNA przy użyciu starterów oraz odpowiednich enzymów. Pozwala na wykrycie niewielkiej ilości DNA w badanym materiale. Jest to metoda o wysokiej specyficzności i czułości. Badanie PCR posiada wiele odmian. Jej niekwestionowaną zaletą jest szybkość uzyskania wyników oraz coraz większa dostępność.

5. 5. Nowoczesne metody wykrywania drobnoustrojów

Do najnowszych technologii umożliwiających identyfikację patogenów zalicza się badanie MALDI-TOF MS. Polega ono na analizie profilu białek komórek bakteryjnych przy użyciu spektrometrii masowej. Jest metodą szczególnie przydatną w celu identyfikacji gronkowców.

Podsumowanie:

Mikrobiologia weterynaryjna to dziedzina, która prężnie się rozwija i zyskuje coraz więcej dostępnych technik badawczych. Hodowle drobnoustrojów bezwzględnie przodują w badaniach mikrobiologicznych. Są stosunkowo tanie, dobrze poznane, zoptymalizowane. Jednak, ze względu na czasochłonność i wymagany duży nakład pracy, małymi krokami są zastępowane przez metody bardziej zautomatyzowane, szybsze w wykonaniu, o większej czułości i specyficzności.

Autor:

lek. wet. Joanna Krupa

Bibliografia:

1. 1. Mikołajczyk A., Właściwości i zastosowanie podłoży bakteriologicznych [w:] Postępy mikrobiologii 2016, 55, 3, s. 320–329
   2. Krutkiewicz A., Kampylobakteriozy u ludzi i zwierząt [w:] Życie weterynaryjne 2008, 83(4), s. 285-288
   3. Dera-Tomaszewska B., Metody typowania bakterii Salmonella [w:] Medycyna weterynaryjna 2011, 67(3), s. 162-167
   4. Adaszek Ł., Zastosowanie techniki PCR w badaniach bakteriologicznych [w:] Życie weterynaryjne 2018, 93(4), s. 234-237
   5. Kizerwetter-Świda M., Problemy weterynaryjnej diagnostyki mikrobiologicznej dotyczącej zakażeń gronkowcowych [w:] Życie weterynaryjne 2018, 93(6), s. 373-376