Techniki oceny jakości nasienia u psów

Wraz z rozwojem możliwości diagnostycznych w medycynie weterynaryjnej, wykonywanie coraz bardziej szczegółowych analiz nasienia znajduje zastosowanie w codziennej pracy lekarzy praktyków zajmujących się rozrodem i andrologią. Zgodnie z wytycznymi WHO, podczas podstawowej oceny jakości nasienia należy wziąć pod uwagę takie parametry jak: ruchliwość, żywotność, koncentracja, morfologia plemników, a także ocena innych komórek znajdujących się w ejakulacie.

Do niedawna ocena jakości nasienia u zwierząt była przeprowadzana jedynie za pomocą mikroskopii świetlnej. Obecnie w andrologii małych zwierząt standardem jest ocena jakości nasienia przy użyciu systemu CASA (Computer Aided Sperm Analsis), a w wyspecjalizowanych laboratoriach andrologicznych możliwe jest również przeprowadzenie bardziej szczegółowej analizy przy pomocy cytometrii przepływowej z wykorzystaniem barwników fluorescencyjnych.

Mikroskopowa ocena jakości nasienia u psów

Ocena mikroskopowa nasienia opiera się na subiektywnej próbie oszacowania procentowej ilości plemników o ruchu progresywnym, ocenie morfologii plemników w barwionym rozmazie oraz manualnym policzeniu plemników przy użyciu komór hemocytometrycznych (np. Neubauera) w celu obliczenia koncentracji nasienia.

Ocena morfologii plemników najczęściej wykonywana jest po zabarwieniu rozmazów z rozrzedzonego nasienia (barwienie metodą Bydgoską lub przy użyciu gotowych barwników np. Sperm Blue, Sperm Stain). Każdorazowo ocenia się 200 plemników i na tej podstawie oblicza się jaki procent plemników stanowią te o prawidłowej budowie.

Barwienie eozynowo-nigrozynowego umożliwia ocenę stosunku ilości żywych i martwych plemników w ejakulacie – żywe nie są zabarwione, a martwe są kolory różowego. Dzięki nigrozynie, tło preparatu ma kolor ciemny, co ułatwia analizę.

Oszacowanie koncentracji plemników w ejakulacie jest możliwe przy użyciu hemocytometru. Metoda ta cechuje się dokładnością, jeśli zwraca się uwagę na prawidłowe przygotowanie rozcieńczenia ejakulatu oraz systematycznie zliczana jest ilość komórek w każdym z kwadratów, minusem metody jest czasochłonność. Manualna ocena ruchliwości ze względu na swój subiektywizm, jest obarczona sporym prawdopodobieństwem wystąpienia błędu.

Ocena jakości nasienia u psów w systemie CASA

System CASA jest to urządzanie będące połączeniem komputera z mikroskopem kontrastowo- fazowym, które umożliwia szybką ocenę parametrów takich jak ruchliwość, ruch progresywny oraz koncentracja. CASA umożliwia również określenie odsetka plemników o ruchu postępowym (PMOT) oraz podział na subpopulacje w zależności od właściwości ruchowych (RAPID, MEDIUM i SLOW), co nie jest możliwe podczas oceny mikroskopowej. W ostatnich latach system CASA przeszedł wiele aktualizacji, które wiążą się z nowymi funkcjami i możliwościami w analizie nasienia. Niektóre, najnowsze systemy CASA umożliwiają ocenę morfologiczną i morfometryczną plemników, a po zainstalowaniu dodatkowego oprogramowania także ocenę żywotności plemników, fragmentacji DNA oraz reakcji akrosomalnej.

Ocena cytometryczna plemników

Ocena właściwości morfo-funkcjonalnych plemników możliwa jest dzięki zastosowaniu cytometrii przepływowej. Stosując barwniki takie jak SYBR-14, PNA, JC-1, C₁₁-BODIPY oraz Oranż Akrydyny można ocenić integralność błonową, integralność akrosomów, aktywność mitochondrialną, strukturę chromatyny oraz peroksydację lipidów błonowych. Metoda ta jednak jest czasochłonna i nie znajduje zastosowania w codziennej praktycze lekarsko-weterynaryjnej.

Autor:

lek. wet. Kinga Domrazek, Pracownia Rozrodu Małych Zwierząt, Katedra Chorób Małych Zwierząt i Klinika, Instytut Medycyny Weterynaryjnej, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego

Bibliografia:

1. 1. A review of WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen (5th edition). (2011).
   2. Daub, L. et al. (2015) ‘Sperm membrane integrity in fresh and frozen–thawed canine semen samples: a comparison of vital stains with the NucleoCounter SP-100’, Theriogenology, 86(2), pp. 651–656. doi: 10.1016/j.theriogenology.2016.02.021.
   3. Johnston, S. D. (1991) ‘Performing a complete canine semen evaluation in a small animal hospital.’, The Veterinary clinics of North America. Small animal practice, pp. 545–551. doi: 10.1016/S0195-5616(91)50060-7.
   4. Kolster, K. A. (2018) ‘Evaluation of Canine Sperm and Management of Semen Disorders’, Veterinary Clinics of North America – Small Animal Practice. W.B. Saunders, pp. 533–545. doi: 10.1016/j.cvsm.2018.02.003.
   5. Lewis-Jones, I. et al. (2003) ‘Sperm chromosomal abnormalities are linked to sperm morphologic deformities’, Fertility and Sterility, 79(1), pp. 212–215. doi: 10.1016/S0015-0282(02)04411-4.
   6. Nizański, W., Partyka, A. and Rijsselaere, T. (2012) ‘Use of Fluorescent Stainings and Flow Cytometry for Canine Semen Assessment’, Reproduction in Domestic Animals, 47(SUPPL. 6), pp. 215–221. doi: 10.1111/rda.12048.
   7. Rijsselaere, T. et al. (2012) ‘Computer-Assisted Sperm Analysis in Dogs and Cats: An Update after 20 Years’, Reproduction in Domestic Animals, 47(SUPPL. 6), pp. 204–207. doi: 10.1111/rda.12057.
   8. van der Horst, G. (2020) ‘Computer Aided Sperm Analysis (CASA) in domestic animals: Current status, three D tracking and flagellar analysis’, Animal Reproduction Science. Elsevier B.V., p. 106350. doi: 10.1016/j.anireprosci.2020.106350.
   9. Watts, J. (2019) ‘Development of a fluorescent computer‐assisted spermatozoal quantification method and a comparison of results for manual counting with a haemocytometer and computer‐assisted semen analysis in dogs’, Reproduction in Domestic Animals, 54(11), pp. 1477–1488. doi: 10.1111/rda.13553.