Wykorzystanie szybkich testów immunochromatograficznych oraz metody PCR do wykrywania szczepionkowego wirusa panleukopenii (FPV) w kale kotów poddawanych wakcynacji.

Panleukopenia jest wirusową chorobą kotów i kotowatych, wywoływaną przez wirus panleukopenii (FPV), blisko spokrewniony z parwowirusem psów. Przyjmuje się, że psi parwowirus typu 2 (CPV-2) wyewoluował z FPV, a mutacje, które powstały w sekwencji aminokwasowej białka kapsydu FPV pozwoliły CPV-2 zaadaptować się do receptorów w komórkach psów, podczas gdy utracił on zdolność zakażania komórek kocich (1).

Wirus panleukopenii

Wirus panleukopenii należy do rodziny Parvoviridae, skupiającej jedne z najmniejszych wirusów. Nie posiada on otoczki i wykazuje znaczną oporność na czynniki fizyczne i chemiczne. Jego materiał genetyczny tworzy pojedyncza nić DNA. W środowisku zewnętrznym, w sprzyjających warunkach, może utrzymywać się przez wiele miesięcy (2), a ponieważ zakażone osobniki wydalają znaczne ilości FPV, głównie z kałem, przyjmuje się, ze środowisko jest powszechnie skażone tym patogenem (zwłaszcza hodowle i schroniska). Wirus panleukopenii jest oporny na większości środków dezynfekcyjnych, dlatego główną metodą walki z chorobą jest prowadzenie immunoprofilaktyki swoistej. Aby zapobiec rozwojowi choroby, do środowiska potencjalnie skażonego wirusem należy wprowadzać wyłącznie osobniki, które zostały zaszczepione przeciwko FPV.

Podobnie jak psi parwowirus, FPV w organizmie kota wykazuje powinowactwo do szybko dzielących się komórek, takich jak komórki Lieberkuhna krypt jelitowych czy komórki Purkinjego w mózgu. Konsekwencją tego jest rozwój zaburzeń ze strony przewodu pokarmowego (wymioty, biegunka) lub nerwowego (ataksja, drgawki). Choroba może rozwinąć się u kotów w każdej grupie wiekowej, aczkolwiek najbardziej wrażliwe na zakażenie są kocięta. W ich przypadku współczynnik śmiertelności może sięgać nawet 90% (3).

Rozpoznawanie panleukopenii

Choroba rozpoznawana jest na podstawie wyników badań serologicznych lub wykazania obecności antygenów wirusa w kale chorych osobników. Badania serologiczne takie jak ELISA, czy odczyn immunofluorescencji pośredniej umożliwiają wykrycie przeciwciał anty-FPV w surowicy kotów, jednak nie różnicują one immunoglobulin powstałych w następstwie naturalnego kontaktu kota z wirusem, od powstałych w następstwie szczepienia. Do wykrywania antygenów FPV w kale posłużyć mogą szybkie testy immunochromatograficzne lub aglutynacji lateksowej. Cechuje je stosunkowo wysoka czułość i swoistość, a prostota ich wykonania powoduje, że są często wykorzystywane w diagnostyce panleukopenii w warunkach gabinetowych. Alternatywę dla szybkich testów stanowi metoda PCR umożliwiająca wykazanie DNA wirusa w kale.

Leczenie panleukopenii

Leczenie panleukopenii jest trudne z uwagi na brak skutecznych preparatów przeciwwirusowych. Postępowanie z chorymi kotami obejmuje podawanie surowicy oraz terapię wspomagającą (nawadnianie, podawanie antybiotyków o szerokim spektrum działania, głównie w stosunku do bakterii Gram-ujemnych oraz beztlenowców)

Profilaktyka panleukopenii

Najlepszą metodę zapobiegania chorobie stanowi immunoprofilaktyka swoista. Szczepienia kotów przeciwko panleukopenii wykonywane mogą być przy użyciu preparatów inaktywowanych, jak i zawierających czynne wirusy (4).

Pierwsze szczepienie w kierunku panleukopenii powinno zostać wykonane w wieku 8 tygodni, natomiast kolejne w odstępach 3 tygodniowych. W uzasadnionych przypadkach (hodowle, azyle lub schroniska) dopuszczalna jest wakcynacja kociąt już w wieku 4-6 tygodni. W takich sytuacjach należy stosować szczepionki inaktywowane, bowiem żywy wirus szczepionkowy u młodych kociąt może doprowadzić do uszkodzenia móżdżku. Szczepienie przypominające powinno być przeprowadzone rok po zakończonej serii szczepień wstępnych. U tak zabezpieczonego kota długość utrzymywania się przeciwciał skutecznie chroniących przed zakażeniem FPV wynosi 3-4 lata, tak więc kolejne wakcynacje zaleca się wykonywać w takich odstępach czasu (5,6).

Po wakcynacji kotów wirusy szczepionkowe mogą być wydalane z kałem zwierząt poddawanych tej immunoprofilaktyce swoistej. Celem badań było określenie, czy szybkie testy diagnostyczne FPV Ag (Vet Expert) oraz technika PCR są w stanie wykryć obecność szczepionkowych wirusów w kale pobranym od kotów szczepionych przeciwko panleukopenii.

Opis doświadczenia

Badania zostały przeprowadzone na 31 dorosłych kotach w wieku powyżej 1 roku, różnej płci, z których 21 stanowiło zwierzęta badane, podzielone na trzy grupy, po 7 osobników każda. W każdej grupie badanej koty poddawane były szczepieniu profilaktycznemu przeciwko panleukopenii innymi preparatami szczepionkowymi. Pozostałe 10 kotów stanowiło grupę kontrolną i nie były poddawane szczepieniom.

Szczepionki kotom grup badanych podawano jednorazowo, po czym od wszystkich zwierząt pobierano kał, (w dniach 2., 5., 7., 10., 14., 20., 25 po przeprowadzonej wakcynacji) do badań molekularnych oraz celem wykonania szybkich testów immunochromatograficznych w kierunku wykrycia antygenów FPV.

Badanie kału metodą PCR w kierunku panleukopenii przeprowadzono wg metody Xue i wsp (7).

Badanie kału metodą immunochromatograficzną wykonano przy użyciu szybkich testów FPV Ag (Vet Expert)

Materiał do badania pobierano higienicznym patyczkiem, lub wymazówką. Próbki kału umieszczano następnie w probówkach zawierających bufor do rozcieńczania. Po wymieszaniu próbki z buforem i opadnięciu części stałych mieszaniny na dno probówki pobierano kroplomierzem zawiesinę. Następnie wprowadzano do okienka testowego płytki 3-4 krople badanej cieczy.. Wynik odczytywano po 10 minutach.

Wyniki i omówienie

Szybkimi testami immunochromatograficznymi w żadnej z badanych próbek pobieranych w odstępie 2-25 dni po wakcynacji nie stwierdzono obecności antygenów wirusów szczepionkowych. Także w grupie kontrolnej wynik tego badania był ujemny.

W grupie kotów badanych w kierunku FPV obecność materiału genetycznego wirusa techniką PCR wykazano u 12 zwierząt (w grupie 1. u 5, w grupie 2. u 3 i w grupie 3. u 4). W kale 10 kotów techniką PCR wirus wykrywany był od 2. do 8. dnia po przeprowadzonej wakcynacji, natomiast w kale pozostałych dwóch od 5. do 20. dnia po szczepieniu.

Techniką PCR wirusa nie wykryto w kale zwierząt kontrolnych.

Obserwacje własne wskazują, iż szybkie testy immunochromatograficzne charakteryzuje niska czułość w wykrywaniu w kale szczepionkowych szczepów FPV, niezależnie od rodzaju użytej szczepionki.

U żadnego z kotów poddawanych wakcynacji nie udało się wykazać testami przez okres 25-dniowej obserwacji obecności wirusa panleukopenii w kale, chociaż techniką PCR był on wykrywany u części zwierząt pomiędzy 2., a 20. dniem po szczepieniu.

Chociaż testy „point of care” nie są w stanie wykryć w kale szczepionkowych szczepów FPV, są przydatne w diagnozowaniu choroby u zwierząt z kliniczną panleukopenią (8). Technika PCR również nie okazała się doskonałą metodą, gdyż przy jej użyciu DNA FPV wykryto jedynie u 12 z 21 (57,14%) kotów poddawanych wakcynacji. Odsetek ten może być jeszcze niższy i wynosić jedynie 7,5% (9).

Podobne obserwacje do prezentowanych w niniejszym artykule poczynili także inni autorzy. Jacobson i wsp. (10) techniką PCR i szybkimi testami przebadali kał 37 kotów poddawanych szczepieniu przeciwko panleukopenii przy użyciu żywych, zmodyfikowanych szczepionek. Wykorzystując szybkie testy, obecność antygenu wirusa wykryli oni w kale jedynie jednego zwierzęcia, podczas gdy techniką PCR materiał genetyczny FPV wykazywano pomiędzy 3., a 7. dniem po przeprowadzonej wakcynacji.

Podsumowując wyniki badań własnych należy stwierdzić, iż szybkie testy immunochromatograficzne nie są zdolne do wykrycia szczepionkowego wirusa panleukopenii w kale kotów poddawanych wakcynacji, natomiast są doskonałym narzędziem do wykrywania tego patogenu u zwierząt zakażonych terenowymi jego szczepami i zdradzających kliniczne objawy choroby (9). Ta różnica w czułości powodowana jest prawdopodobnie zbyt małą ilością wirusów szczepionkowych w kale, będącą poniżej limitu wykrywalności testów. W przypadkach chorobowych miana wirusa są znacznie wyższe, dzięki czemu mogą być one wychwycone przez testy. Podobną prawidłowość obserwuje się dla szczepionkowych parwowirusów psów (11) .

Niska czułość w wykrywaniu wirusów szczepionkowych wcale nie jest wadą omawianych zestawów diagnostycznych. W sytuacji gdy u zwierzęcia zaszczepionego dojdzie do nadkażenia terenowym szczepem FPV, mając wiedzę, że szybkie testy nie są w stanie wykryć wirusa szczepionkowego, potwierdzenie obecności wirusa panleukopenii w kale u tego typu pacjentów będzie wskazywało, iż mamy do czynienia z pełnozjadliwym patogenem. Innymi słowy, testy te pozwalają różnicować pacjentów po szczepieniach z biegunkami na innym tle niż FPV, z pacjentami po wakcynacji u których doszło do nadkażenia tymi patogenami i rozwoju panleukopenii.

Streszczenie

Celem badań było określenie, czy szybkie testy diagnostyczne FPV Ag (Vet Expert), są w stanie wykryć obecność szczepionkowych wirusów w kale pobranym od kotów szczepionych przeciwko panleukopenii. Badanym kotom szczepionki podawano jednorazowo, po czym od wszystkich zwierząt pobierano kał w dniach 2., 5., 7., 10., 14., 20., 25. po przeprowadzonej wakcynacji do badań molekularnych oraz celem wykonania szybkich testów immunochromatograficznych w kierunku wykrycia antygenów FPV.

U żadnego z kotów poddawanych wakcynacji w kale nie udało się wykryć testami przez okres 25-dniowej obserwacji obecności FPV, chociaż techniką PCR DNA tego patogenu wykryto u 12 osobników pomiędzy 2., a 20. dniem po przeprowadzonym szczepieniu.

Podsumowując wyniki badań własnych należy stwierdzić, iż szybkie testy immunochromatograficzne nie są zdolne do wykrycia szczepionkowych FPV, natomiast są doskonałym narzędziem do wykrywania tego patogenu u zwierząt zakażonych terenowymi jego szczepami i zdradzającymi kliniczne objawy choroby.

Autorzy:

Prof. dr hab. Łukasz Adaszek, dr Marcin Garbal, lek. wet. Maria Pisarek, dr Marta Staniec, lek. wet. Małgorzata Rutkowska-Szulczyk**, lek. wet. Łukasz Deneka**

Katedra Epizootiologii i Klinika Chorób Zakaźnych Wydział Medycyny Weterynaryjnej UP w Lublinie, ul. Głęboka 30, 20-612 Lublin

*VetHouse Specjalistyczne Centrum Weterynaryjne, Wróbla 66/lok 2, 20-719 Lublin

**Vet Planet Sp. z o.o. ul. Brukowa 36 lok. 2, 05-092 Łomianki

Słowa kluczowe: koty, FPV, PCR, testy immuochromatograficzne